人源菌群仔豬模型的建立及其胃腸道黏膜免疫的研究.pdf

1、本研究首先利用豬在解剖、組織、生理和營(yíng)養(yǎng)代謝尤其是消化系統(tǒng)方面與人高度相似的特性，摸索建立一種腸道中定植人源菌群（Human Flora-associated,HFA）的仔豬模型；研究人的腸道共生菌對(duì)該模型仔豬胃腸道形態(tài)、血清中促炎細(xì)胞因子和局部黏膜免疫細(xì)胞的影響；在此基礎(chǔ)上，探討腸道優(yōu)勢(shì)菌群對(duì)無菌仔豬胃腸道黏膜免疫影響的可能機(jī)制；在該模型建立的基礎(chǔ)上，研究果寡糖類益生元對(duì)人源菌群仔豬腸道黏膜免疫的影響.結(jié)果如下：
　　 1人源

2、菌群仔豬模型的建立
　　 為了成功建立人源菌群仔豬模型，本試驗(yàn)通過五次獨(dú)立試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)仔豬的品種、糞懸液的來源和飼養(yǎng)管理?xiàng)l件等進(jìn)行了探討.前兩次試驗(yàn)選用貴州香豬，后三次試驗(yàn)選用中國(guó)的土種豬梅山豬.將無菌剖腹產(chǎn)手術(shù)獲得的仔豬通過傳遞窗快速送入無菌屏障系統(tǒng)，試驗(yàn)均在無菌屏障系統(tǒng)中完成.五次試驗(yàn)中所用的無菌仔豬頭數(shù)依次分別為9,13,10,12,8頭.仔豬出生12h后，在確認(rèn)仔豬吃乳和健康狀況良好的情況下，經(jīng)口服途徑接種人糞便菌懸液.前

3、三次試驗(yàn)采用一健康10歲兒童的糞便菌懸液，后兩次試驗(yàn)采用健康成人的糞便菌懸液.前3d每只仔豬每天接種1m1，4-10日齡每隔1d接種一次，劑量為1ml/次.在飼養(yǎng)管理過程中，采用人工哺乳的方法飼喂仔豬，斷奶前采用豬用奶粉，斷奶后采用嬰兒米粉.合理控制飼養(yǎng)室的溫度.適時(shí)補(bǔ)充鐵劑、維生素和微量元素.觀察仔豬的精神狀態(tài)和生長(zhǎng)情況，分析不同時(shí)間段仔豬的成活率.結(jié)果顯示，與貴州香豬相比，梅山豬的生長(zhǎng)發(fā)育很好，成活率明顯升高；灌喂健康成人糞便菌懸液

4、的梅山豬比健康兒童糞便菌懸液的生長(zhǎng)發(fā)育要好，成活率也高.試驗(yàn)結(jié)果表明選用梅山豬和健康成人的糞便菌懸液更適合于建立人源菌群仔豬模型.
　　 2人的腸道共生菌對(duì)人源菌群仔豬胃腸道形態(tài)和血清中促炎細(xì)胞因子的影響
　　 將無菌剖腹產(chǎn)手術(shù)獲得的16頭健康無菌仔豬稱重，隨機(jī)分為兩組，人源菌群組（HFA，n=8）和豬源菌群組（PFA,n=8），分別口服接種人和豬的糞便菌懸液.所有仔豬飼養(yǎng)于無菌的屏障系統(tǒng)內(nèi)，人工哺乳喂養(yǎng).6周后空腹稱重

5、，靜脈放血處死動(dòng)物，收集血液離心取血清；采集胃腸放入Bouin’s液中固定.應(yīng)用H/E染色顯示胃腸組織學(xué)形態(tài).應(yīng)用ELISA試劑盒測(cè)定血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的水平，結(jié)果顯示：1）兩組仔豬生長(zhǎng)發(fā)育很好，但人源菌群組仔豬的日增重顯著高于豬源菌群組(p＜0.05).2)人源菌群組仔豬的空腸絨毛高度和隱窩深度顯著高于豬源菌群組(p＜0.05).3)與豬源菌群組仔豬相比，人源菌群仔豬血清中的促炎細(xì)胞因子TNF-α顯著降低(p＜0

6、.05)，IL1β的水平很低，用試劑盒幾乎檢測(cè)不到.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人的腸道共生菌定植在仔豬腸道后，刺激了仔豬空腸的發(fā)育，促進(jìn)了仔豬的生長(zhǎng)，對(duì)維持機(jī)體的健康起到重要作用.
　　 3人的腸道共生菌對(duì)人源菌群仔豬胃腸道局部黏膜免疫水平的影響
　　 取人源菌群組（HFA,n=8）和豬源菌群組（PFA,n=8）仔豬的胃底部、胃體部、胃幽門部，十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸組織樣品，應(yīng)用組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)方法來檢測(cè)胃腸道黏膜免疫細(xì)胞的

7、變化.結(jié)果顯示：1)人源菌群仔豬小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量極顯著低于豬源菌群仔豬(p＜0.01)；含中性黏蛋白的杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著升高(p＜0.05)，但小腸中總的杯狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞的數(shù)量差異不顯著.2）與豬源菌群組仔豬相比，人源菌群組仔豬胃幽門部(p＜0.05)和空腸(p＜0.01)中IgA生成細(xì)胞的面積均顯著增加.胃的三個(gè)部位中IgG生成細(xì)胞的面積均有增加，但差異不顯著；十二指腸、空腸和回腸中IgG生成細(xì)胞的面積均極顯著增加(p＜0.0

8、1).3)與豬源菌群組仔豬相比，人源菌群組仔豬空腸中CD4+T細(xì)胞的含量極顯著增高(p＜0.01).4)人源菌群組仔豬腸黏膜中MHCⅡ類分子表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量在十二指腸(p＜0.01)和結(jié)腸(p＜0.05)中分別顯著高于豬源菌群組仔豬.5）IgA和IgG生成細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和MHCⅡ類分子表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量在兩組仔豬的腸道中具有類似的分布趨勢(shì).上述結(jié)果表明人的腸道共生菌群刺激了無菌仔豬小腸局部黏膜免疫功能的增強(qiáng)，但未改變黏膜免疫細(xì)胞在腸道不

9、同部位的分布特征.
　　 4人源菌群仔豬腸道優(yōu)勢(shì)菌群組成的研究
　　 收集人源菌群組（HFA,n=8）和豬源菌群組(PFA,n=8)仔豬的糞便樣品，應(yīng)用微生物分子生態(tài)學(xué)方法測(cè)定糞便樣品中四種主要優(yōu)勢(shì)菌群，擬桿菌類群、梭菌類群、雙歧桿菌類群和乳酸菌類群的含量和雙歧桿菌的組成.結(jié)果顯示：1)腸道的優(yōu)勢(shì)菌群如擬桿菌、梭菌、雙歧桿菌和乳酸菌在人源菌群仔豬和豬源菌群仔豬的糞便樣品中都能檢測(cè)到.人糞便中的擬桿菌和梭菌的含量極顯著高于

10、人源菌群仔豬，但乳酸菌的含量則極顯著低于人源菌群仔豬(p＜0.01),雙歧桿菌的含量沒有顯著差異；豬糞便中的擬桿菌類群的含量極顯著低于豬源菌群仔豬(p＜0.01)，梭菌、雙歧桿菌和乳酸菌的含量沒有明顯差異.2）與豬源菌群組仔豬相比，人源菌群組仔豬糞便中雙歧桿菌的含量極顯著增高(p＜0.01)，而且兩組仔豬糞便中雙歧桿菌的組成也不同，其他三種菌群的含量沒有明顯差異.試驗(yàn)結(jié)果表明人源菌群仔豬的腸道菌群組成和數(shù)量明顯不同于豬源菌群仔豬，提示腸

11、道共生菌對(duì)腸道健康和發(fā)育具有重要的作用.
　　 5果寡糖對(duì)人源菌群仔豬腸道黏膜免疫細(xì)胞的影響
　　 將無菌剖腹產(chǎn)手術(shù)獲取的15頭健康仔豬稱重，隨機(jī)分為三組：第一組為SPF組（Specific Pathogen Free，對(duì)照組），經(jīng)口灌服磷酸鈉緩沖液（內(nèi)含10％甘油）；第二組為HFA組（人源菌群組），經(jīng)口灌服人糞便菌懸液，前三天每只仔豬每天灌服1ml菌液，4-10日齡每隔一天灌服菌液一次，劑量仍為1ml；第三組為FOS組

12、（Fructo-oligosaccharides，果寡糖組），每頭仔豬除灌服人糞便菌懸液外，在整個(gè)飼養(yǎng)期內(nèi)按0.5g/kg體重飼喂果寡糖.所有仔豬飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)內(nèi)，無菌條件下進(jìn)行人工哺育.45d后空腹稱重，宰殺取十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸.應(yīng)用組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)方法研究仔豬腸道黏膜免疫細(xì)胞的變化.結(jié)果顯示：1）果寡糖能夠提高仔豬的日增重.2）與人源菌群組相比，果寡糖能夠使空腸中IgA生成細(xì)胞的含量顯著增高(p＜0.05)，使IgG生