復(fù)方陳皮粉對(duì)豬胃腸道菌群多樣性的影響.pdf

1、本研究以飼喂復(fù)方陳皮粉的試驗(yàn)組和未飼喂復(fù)方陳皮粉的對(duì)照組的豬糞便樣品作為研究對(duì)象，通過宏基因組學(xué)方法和宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究?jī)山M試驗(yàn)豬胃腸道中微生物的多樣性，并通過比較兩組微生物多樣性分析復(fù)方陳皮粉對(duì)豬胃腸道微生物的影響，從而進(jìn)一步分析復(fù)方陳皮粉藥效的作用機(jī)制。
　　將60頭試驗(yàn)豬隨機(jī)分為2個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭豬；對(duì)照組和試驗(yàn)組分別飼喂基礎(chǔ)日糧和添加0.2％復(fù)方陳皮粉的基礎(chǔ)日糧，共計(jì)60 d；飼喂過程定期采集新鮮糞便，

2、采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）和末端限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）指紋圖譜技術(shù)研究?jī)山M試驗(yàn)豬胃腸道菌群多樣性；結(jié)合雙向電泳和質(zhì)譜鑒定方法分析差異蛋白質(zhì)，并于NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)差異蛋白質(zhì)種類，進(jìn)一步研究胃腸道菌群結(jié)構(gòu)；再結(jié)合內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)分析胃腸道內(nèi)毒素含量，分析復(fù)方陳皮粉對(duì)胃腸道革蘭氏陰性菌及其釋放的內(nèi)毒素的影響。
　　結(jié)果表明，試驗(yàn)期間試驗(yàn)組的豬基本不出現(xiàn)腹瀉，對(duì)照組有部分豬經(jīng)常出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象。DGGE圖譜顯示

3、，豬胃腸道菌群物種豐富，兩組樣品之間存在明顯的條帶差異。選取11條 DGGE共性條帶和特異條帶進(jìn)行克隆測(cè)序，用BLAST工具與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列進(jìn)行比對(duì)，其中兩組的共性條帶對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)中最相近菌種為大腸桿菌、厚壁菌門中的不可培養(yǎng)的一個(gè)菌種、桿菌門中的不可培養(yǎng)的一個(gè)新種和鏈球菌屬的新種。對(duì)照組特有條帶對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)中最相近菌種為密螺旋體屬的新種、變形菌門中的不可培養(yǎng)的一個(gè)新種和產(chǎn)氣莢膜梭菌屬的新種。試驗(yàn)組特有條帶對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)中最

4、相近菌種為鼠李糖乳桿菌、柔嫩梭菌屬的新種、類腸膜明串珠菌屬的新種和嗜酸乳桿菌屬的新種。
　　T-RFLP指紋圖譜技術(shù)檢測(cè)結(jié)果通過RDP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢比對(duì)，在兩組糞便樣品中，相同的T-RFs片段有27個(gè)，包括14個(gè)屬，分別為類芽孢桿菌屬、密螺旋體屬、微小桿菌屬、梭菌屬、乳桿菌屬、螺桿菌屬、優(yōu)桿菌屬、噬纖維菌屬、組織菌屬、丁酸弧菌屬、魏斯氏菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬和硝化螺旋菌屬。其中大部分是機(jī)會(huì)致病菌和動(dòng)物胃腸道中的正常菌群成員，僅有少部

5、分為致病菌。對(duì)照組的特有片段中對(duì)應(yīng)的細(xì)菌種類為有益菌、致病菌和機(jī)會(huì)致病菌，其中大部分為有害菌和機(jī)會(huì)致病菌。試驗(yàn)組特有的片段對(duì)應(yīng)的細(xì)菌種類雖然也有有益菌、致病菌和機(jī)會(huì)致病菌，但致病菌和機(jī)會(huì)致病菌的數(shù)量明顯少于對(duì)照組，有益菌占多數(shù)。通過比較蛋白組學(xué)在兩組樣品中獲得的多個(gè)差異蛋白點(diǎn)，選擇其中7個(gè)相對(duì)清晰的差異蛋白點(diǎn)通過數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比得出其對(duì)應(yīng)的細(xì)菌種屬為腸炎沙門氏菌、密螺旋體、鼠李糖乳桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、蠟樣芽孢桿菌、小牛葡萄球菌、豬丹毒絲菌。所

6、取的差異蛋白點(diǎn)1個(gè)來(lái)自試驗(yàn)組中較清晰的蛋白點(diǎn)為鼠李糖乳桿菌，6個(gè)來(lái)自對(duì)照組中較清晰的蛋白點(diǎn)，這六種被鑒定的蛋白質(zhì)均為致病菌或機(jī)會(huì)致病菌。
　　對(duì)照組與試驗(yàn)組在飼喂復(fù)方陳皮粉初期胃腸道的游離內(nèi)毒素濃度相差不大，但是在中后期兩組的內(nèi)毒素濃度出現(xiàn)了比較大的差異。對(duì)照組的內(nèi)毒素濃度總體呈上升趨勢(shì)，而試驗(yàn)組雖有略微差異，但幅度不大，呈平穩(wěn)趨勢(shì)。第20 d以后，試驗(yàn)組與對(duì)照組之間內(nèi)毒素濃度差異顯著（P<0.05）。
　　綜合本實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)