ε-聚賴氨酸抑制致病菌分子機(jī)理及對(duì)腸道菌群多樣性影響的研究.pdf

1、ε-聚賴氨酸(ε-PL)是天然存在的一類聚氨基酸，具有對(duì)細(xì)菌、酵母菌、霉菌的廣譜抗性，且安全無(wú)毒、水溶性好、熱穩(wěn)定性高。作為逐漸被推廣使用的食品防腐劑，其抗菌的分子機(jī)制尚未清晰闡明。
　　本論文通過(guò)微生物培養(yǎng)，原子力顯微鏡(AFM)和透射電子顯微鏡(TEM)觀察，抑制消減雜交文庫(kù)篩選，實(shí)時(shí)定量PCR和基因敲除等技術(shù)，并根據(jù)不同技術(shù)選取適合的研究對(duì)象，對(duì)ε-PL抑制典型致病菌（食源性、醫(yī)源性）的現(xiàn)象和分子機(jī)制進(jìn)行了深入的研究。最后采

2、用PCR-DGGE技術(shù)，評(píng)估了口服ε-PL對(duì)小鼠腸道微生態(tài)菌群的影響。
　　論文分為六個(gè)章節(jié)。第一章對(duì)食品防腐劑，尤其是天然防腐劑的分布、性質(zhì)、特性進(jìn)行了描述，重點(diǎn)對(duì)天然微生物抗菌劑ε-PL的理化性質(zhì)、抗菌活性及機(jī)制，應(yīng)用范圍和發(fā)展方向進(jìn)行了系統(tǒng)的闡述。
　　在第二章中，以EscherichiacoliO157∶H7為模式微生物，系統(tǒng)探討了ε-PL對(duì)致病菌的抑菌活性和分子機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ε-PL拮抗E.coliO157∶H7的

3、活性隨溫度的升高(4℃、25℃和37℃)和處理時(shí)間的延長(zhǎng)(0～15h)遞增;在pH5～7環(huán)境中抑菌活性沒(méi)有顯著變化，在pH大于8時(shí)活性降低。AFM和TEM觀察結(jié)果表明，ε-PL能破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，形成膜穿孔，使胞質(zhì)呈不均勻分布，細(xì)胞內(nèi)容物泄漏。ε-PL能誘導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，且其濃度隨著ε-PL濃度的增加而升高。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，ε-PL能對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生氧脅迫，損傷細(xì)菌DNA，并抑制E.coliO157∶H7的侵染毒力。

4、　　為進(jìn)一步研究ε-PL的抑菌分子機(jī)理，探討其對(duì)致病菌的基因調(diào)控影響，在第三章中以常見(jiàn)感染且難以抑殺的條件致病菌-白色念珠菌(CandidaalbicansATCC14053)為研究對(duì)象，采用SSH技術(shù)對(duì)ε-PL抑菌前后的差異基因進(jìn)行了篩選。RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，在ε-PL亞致死濃度脅迫下，C.albicans有10個(gè)發(fā)生差異表達(dá)的基因，表明ε-PL能通過(guò)降低糖酵解和脂類代謝相關(guān)基因的表達(dá)，抑制C.albicans的糖代謝并導(dǎo)致C

5、.albicans中脂類代謝的紊亂。蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因GCN1、精氨酸t(yī)RNA合成酶及泛素蛋白連接酶Asi3的上調(diào)表達(dá)則表明，ε-PL的抑菌活性能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并促進(jìn)C.albicans蛋白的降解。
　　通過(guò)基因敲除造成基因缺失是進(jìn)一步驗(yàn)證ε-PL抑菌分子機(jī)制的有效方法。腸炎沙門氏菌是污染食品的主要食源性致病菌，其雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)以特定的方式調(diào)控沙門氏菌的毒力，抵抗抗菌肽的抑菌作用。基于沙門氏菌的基因敲除系統(tǒng)有方法成熟，且操作簡(jiǎn)

6、單的優(yōu)勢(shì)，在第四章中，通過(guò)敲除S.enteritidis中抵抗抗菌肽的調(diào)控系統(tǒng)PhoP-PhoQ和RcsFCDB中的關(guān)鍵基因PhoP和rcsF,比較了ε-PL對(duì)S.enteritidis野生株和基因敲除株的相關(guān)基因表達(dá)影響的差異，探討其抑制S.enteritidis的分子機(jī)制。結(jié)果顯示S.enteritidisΔphoP對(duì)ε-PL的敏感性顯著增加，且PhoP-PhoQ所調(diào)控的下游基因的表達(dá)顯著下降，而S.enteritidisΔrcsF

7、在ε-PL中的生長(zhǎng)速率較之野生株沒(méi)有顯著差異，表明PhoP-PhoQ調(diào)控系統(tǒng)在S.enteritidis抵抗ε-PL的過(guò)程中起到關(guān)鍵性的作用，而RcsFCDB調(diào)控系統(tǒng)則不能被ε-PL激活。
　　ε-PL作為食品防腐劑，是否會(huì)對(duì)機(jī)體腸道微生態(tài)菌群平衡造成影響，未見(jiàn)報(bào)道。在第五章中，采用PCR-DGGE和RT-qPCR相結(jié)合的方法，分析了灌胃ε-PL兩周過(guò)程中小鼠糞便中菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化。結(jié)果顯示，乳桿菌屬菌群多樣性有所增加。乳桿菌