ε-聚賴氨酸合成機(jī)理及發(fā)酵條件研究.pdf

1、以實(shí)驗(yàn)室篩選高產(chǎn)菌株Streptomyces griseolus作為出發(fā)菌種發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸，研究其發(fā)酵最佳的培養(yǎng)基成分，優(yōu)化發(fā)酵工藝，達(dá)到提高ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的目的，擴(kuò)大至發(fā)酵罐發(fā)酵，制定合理的提純工藝，對其合成產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，從GeneBank中搜索已知產(chǎn)ε-聚賴氨酸菌株登陸的編號AB385841中獲取pls片段序列(gene for epsilon-poly-L-lysine synthase)設(shè)計(jì)合理引物擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室菌株基因組序

2、列，通過測序等分析手段初步研究。主要的結(jié)論如下：
　　搖瓶發(fā)酵方面，試驗(yàn)在優(yōu)化培養(yǎng)基基礎(chǔ)上輔以D152樹脂原位分離發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)甘油與D-木糖按照3:7混合作為復(fù)配碳源，(NH4)2SO4與酵母粉按照1:1.25混合作為復(fù)配氮源時，產(chǎn)量最高為1.76g/L，相比于優(yōu)化前的發(fā)酵產(chǎn)量、比發(fā)酵量和發(fā)酵效率分別提高了30.1％、18.8%和17.1%。
　　原位分離實(shí)驗(yàn)還證明ε-聚賴氨酸添加后的反饋抑制作用并不十分明顯，但使用

3、D152樹脂后，對比空白對照ε-聚賴氨酸產(chǎn)量提高了24.8%。證明D152樹脂消除了一些在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的較強(qiáng)的反饋抑制作用物質(zhì)，對比還原糖的消耗，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵效率提高了13.38%。
　　ε-聚賴氨酸帶有正電荷，故選用陽離子交換樹脂D152作為吸附劑進(jìn)行產(chǎn)物的純化回收，制定的回收工藝為：樹脂在中性條件下25℃震蕩吸附30min；洗脫液HCl濃度為0.1mol/L，洗脫條件150r/min，溫度30℃，時間60min；使用乙酸乙醚（2

4、:1）沉淀，過濾后溶解通過Sephadex G-25凝膠柱，流速為4ml/L，后用ddH2O洗脫，收集洗脫液冷凍真空濃縮，即得純品。該工藝下，樹脂吸附量為101.6g/L，解析率為91.6%，最終計(jì)算其回收效率為77.5%，產(chǎn)物純度可達(dá)94%。
　　純化后樣品經(jīng)薄層層析，證實(shí)樣品水解產(chǎn)物與賴氨酸、ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品水解產(chǎn)物具有相同的RF值，確認(rèn)產(chǎn)物為賴氨酸聚合物，再經(jīng)核磁共振波譜驗(yàn)證，產(chǎn)物出峰與峰面積比均與文獻(xiàn)一致，確認(rèn)產(chǎn)物為ε-

5、聚賴氨酸。
　　發(fā)酵罐階段以搖瓶發(fā)酵為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，采用兩階段控制pH法進(jìn)行發(fā)酵過程調(diào)控，重點(diǎn)研究了pH值與攪拌速率對發(fā)酵體系的作用影響，優(yōu)化發(fā)酵罐條件為350r/min，30℃，磷酸鹽調(diào)節(jié)初始發(fā)酵pH5.75，發(fā)酵過程pH自然下降至3.75時用10%氨水維持pH直至發(fā)酵結(jié)束，溶氧初始為100%，待自然下降至30%后，調(diào)節(jié)通風(fēng)比維持溶氧直至發(fā)酵結(jié)束。實(shí)驗(yàn)所得菌體生物量為12.6g/L，ε-PL的產(chǎn)量2.75g/L，優(yōu)化前發(fā)酵罐產(chǎn)生物量

6、為7.48g/L，ε-PL的產(chǎn)量2.17g/L，而實(shí)驗(yàn)室搖瓶發(fā)酵的生物量和ε-PL的產(chǎn)量僅分為4.32 g/L和1.78 g/L，優(yōu)化后產(chǎn)量提高了54.5%。
　　為從基因水平驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)篩選菌株所與標(biāo)準(zhǔn)對照菌株的同源性，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單的擴(kuò)增基因序列手段，并進(jìn)行測序?qū)Ρ龋瑢Ρ染陮?shí)驗(yàn)采用Yoshimitsu Hamano貢獻(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)菌其Gene Bank登陸號為AB385841，通過設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增測序后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室篩選菌株該片段同源性為42.