高產(chǎn)ε-聚賴(lài)氨酸白色鏈霉菌的誘變育種與發(fā)酵優(yōu)化.pdf

1、ε—聚賴(lài)氨酸(ε—polylysine，ε—PL)是80年代由日本首先發(fā)現(xiàn)由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一種新型食品抑菌劑，其化學(xué)組成是由人體必需氨基酸L—賴(lài)氨酸構(gòu)成的多肽，它經(jīng)消化后又可變成單一的賴(lài)氨酸而成為人體營(yíng)養(yǎng)的強(qiáng)化劑，已作為GRAS物質(zhì)通過(guò)了美國(guó)FDA認(rèn)證，CAS登記號(hào)為28211—04-3，標(biāo)志著ε—聚賴(lài)氨酸已被國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)所認(rèn)可。故聚賴(lài)氨酸作為食品防腐劑，具有無(wú)毒副作用，安全性高的特點(diǎn)。 本課題對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的一株具有ε—聚賴(lài)氨酸生

2、產(chǎn)能力菌株白色鏈霉菌StreptomycesalbulusSA進(jìn)行研究，通過(guò)對(duì)其分泌產(chǎn)物與帶電染料的靜電作用及Dragendorff試劑反應(yīng)和產(chǎn)物的氨基酸組成分析可以得出，ε—聚賴(lài)氨酸帶正電荷，是一種生物堿物質(zhì)并且為L(zhǎng)—賴(lài)氨酸的聚合物。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，為篩選和驗(yàn)證具有ε—聚賴(lài)氨酸生產(chǎn)能力的菌株提供了簡(jiǎn)便而快捷的方法。 對(duì)白色鏈霉菌StreptomycesalbulusSA進(jìn)行誘變選育，首先研究了紫外線(xiàn)復(fù)合氯化鋰誘變中不同的照射劑量

3、對(duì)細(xì)胞存活率的影響得到了致死率曲線(xiàn)，根據(jù)遺傳育種的經(jīng)驗(yàn)，正向突變較多發(fā)生在偏低劑量中，確定了以25s作為最適紫外誘變劑量。初篩采用打孔瓊脂柱抑菌圈法可以大批量并快速選出抑菌效果顯著的菌株，經(jīng)過(guò)復(fù)篩得到一株產(chǎn)量為1.33gA，的突變株UL2-7，產(chǎn)量提高了27.9％。 以紫外誘變獲得的突變株UL2-7作為出發(fā)菌株，進(jìn)行亞硝酸誘變篩選AEC抗性菌株，根據(jù)誘變劑量對(duì)細(xì)胞存活率的影響得到了致死率曲線(xiàn)，確定20min的處理時(shí)間作為最適亞硝

4、酸誘變劑量。通過(guò)復(fù)篩得到高產(chǎn)菌株UN2-71，ε—聚賴(lài)氨酸產(chǎn)量為1.64g/L，提高了57.7％。 對(duì)誘變得到的菌株UN2-71進(jìn)行發(fā)酵穩(wěn)定性能研究，經(jīng)過(guò)5次傳代實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明突變株性狀穩(wěn)定，并對(duì)白色鏈霉菌UN2-71的培養(yǎng)特性及生理生化特性進(jìn)行了觀(guān)察。 對(duì)不同碳源和氮源對(duì)ε—聚賴(lài)氨酸產(chǎn)量的影響進(jìn)行了研究，得到可溶性淀粉是最佳碳源，而(NH)2SO4和酵母提取物的組合是最佳氮源。在碳源、氮源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基

5、的優(yōu)化，對(duì)培養(yǎng)基八種成分可溶性淀粉、硫酸銨、酵母提取物、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O進(jìn)行了Plackett—Burman篩選試驗(yàn)，得到可溶性淀粉、硫酸銨和酵母提取物為顯著影響因素，對(duì)這三因子進(jìn)行三水平的Box—Behnken試驗(yàn)，通過(guò)RSM分析得到優(yōu)化模型，優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為：可溶性淀粉40g、硫酸銨8g、酵母提取物6.4557g、K2HPO40.8g、KH2PO41.3