類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者腸道菌群分析及致病菌篩選.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性、進(jìn)行性、侵襲性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫病。隨著病情逐漸發(fā)展，若不經(jīng)有效治療，患病者最終會(huì)產(chǎn)生關(guān)節(jié)畸形、功能喪失，甚至致殘。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在世界范圍內(nèi)分布，患者數(shù)量達(dá)千萬(wàn)，發(fā)病率具有種族差異，各年齡段均可發(fā)病，高峰年齡在30-50歲之間，一般女性多于男性。研究表明，RA的發(fā)生與遺傳因素和環(huán)境因素密切相關(guān)，但其發(fā)病機(jī)制仍未確定。近年來(lái)，越來(lái)越多的關(guān)注逐漸轉(zhuǎn)向環(huán)

2、境因素中的腸道菌群與RA的相關(guān)性上。
　　目的:
　　本課題通過(guò)分析RA患者腸道菌群的分布特點(diǎn)，對(duì)RA患者的特異性腸道細(xì)菌進(jìn)行體外分離篩選，并進(jìn)行菌種鑒定。建立大鼠關(guān)節(jié)炎模型，使用篩選到的特征性細(xì)菌進(jìn)行灌胃，觀察特征性細(xì)菌對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)生的影響，確定篩選到的特征性細(xì)菌的致病性，為深入研究腸道菌群影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.收集類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和健康人糞便，通過(guò)PCR-DGGE(Den

3、aturing Gradient Gel Electrophoresis)方法分析類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者腸道菌群的特異性，16S rRNA V3區(qū)測(cè)序比對(duì)分析確定菌種，找出特征性細(xì)菌。
　　2.利用選擇性培養(yǎng)基，對(duì)RA患者糞便中的特征性細(xì)菌進(jìn)行分離篩選，體外培養(yǎng)增殖。采用16S rRNA V3區(qū)測(cè)序比對(duì)分析鑒定細(xì)菌菌種。
　　3.采用弗氏完全佐劑處理大鼠，建立關(guān)節(jié)炎敏感動(dòng)物模型，將從RA患者糞便中分離到的特征性細(xì)菌對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，

4、采用多項(xiàng)指標(biāo)確認(rèn)特征性細(xì)菌誘發(fā)了RA疾病的發(fā)生。檢測(cè)指標(biāo)包括:HE染色觀察大鼠踝關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)改變;ELISA檢測(cè)大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量。
　　4.將RA大鼠腸道菌群與RA臨床患者的腸道菌群做比較，以篩選出更多的與RA疾病相關(guān)的腸道致病菌。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)DGGE圖譜分析發(fā)現(xiàn)，RA患者腸道菌群的多樣性低于健康人腸道菌群，且菌群分布具有特異性。同時(shí)確定了3種可能致病的特征性細(xì)菌:屎腸球菌(Ent

5、erococcusa faecium)，大腸桿菌(Escherichia coli)和短乳桿菌(Lactobacillus bervis)。
　　2.采用選擇性培養(yǎng)基，對(duì)RA患者糞便中細(xì)菌進(jìn)行體外培養(yǎng)。經(jīng)16S rRNA V3區(qū)測(cè)序比對(duì)分析，在培養(yǎng)出的細(xì)菌中成功分離出該3種特征性細(xì)菌。
　　3.將該3種細(xì)菌分別給大鼠灌胃后，屎腸球菌和短乳桿菌灌胃的兩組大鼠關(guān)節(jié)發(fā)生形變，甚至出現(xiàn)行走障礙。通過(guò)HE染色觀察到其踝關(guān)節(jié)受損，利用E

6、LISA檢測(cè)到大鼠血清中兩組TNF-α和IL-1β含量均有顯著性升高，而大腸桿菌組變化不顯著。
　　4.與RA患者腸道菌群類似，腸道菌群出現(xiàn)了乳桿菌屬細(xì)菌的增加;RA大鼠腸道菌群中還檢測(cè)到了普氏菌屬。
　　結(jié)論:
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者腸道菌群與健康組比較具有明顯差異。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從患者糞便中分離出的屎腸球菌和短乳桿菌可誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。對(duì)RA大鼠腸道菌群檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了動(dòng)物乳桿菌，提示乳桿菌屬細(xì)菌與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有相關(guān)