出生至斷奶仔豬胃腸道FcRn表達(dá)規(guī)律及其與IgG轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)系的研究.pdf

1、仔豬成活率一直是影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要因素之一，而母乳的免疫球蛋白水平及其向仔豬的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)仔豬早期存活至關(guān)重要。剛出生的仔豬體內(nèi)抗體基本為零，新生仔豬的免疫主要來(lái)自初乳中的母源抗體提供的被動(dòng)免疫。IgG是家畜初乳中含量最豐富的免疫球蛋白成分，IgG由乳腺向乳汁中的分泌以及新生動(dòng)物對(duì)乳中母源IgG的攝取均需要穿越上皮細(xì)胞屏障，即進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)作用，這一過(guò)程是由受體介導(dǎo)的，而特異性轉(zhuǎn)運(yùn)IgG的唯一受體是新生兒Fc受體(neonatal Fc re

2、ceptor，F(xiàn)cRn)。 研究表明，F(xiàn)cRn具有獨(dú)特的重要功能，它不僅在IgG從母體劍仔畜的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著極其重要的作用，而且在成年動(dòng)物體內(nèi)終生表達(dá)，維持血液IgG和清蛋白水平的相對(duì)平衡和穩(wěn)定，F(xiàn)cRn還與動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和免疫應(yīng)答密切相關(guān)。對(duì)該受體的研究可以揭示機(jī)體免疫球蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，從而對(duì)臨床應(yīng)用和生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的理論指導(dǎo)價(jià)值。 本研究以大白和長(zhǎng)白二元雜交仔豬作為研究對(duì)象，分別采集從出生當(dāng)天至斷奶后共12個(gè)日齡仔豬

3、血液和肝、腎、脾、心臟、胃以及腸道各段組織，進(jìn)行了如下方面的試驗(yàn)。 1.應(yīng)用RT-PCR方法研究了FcRn在仔豬體內(nèi)不同組織的表達(dá)分布及不同日齡仔豬胃腸道FcRn的表達(dá)變化。結(jié)果表明，F(xiàn)cRn在仔豬肝、腎、脾、心臟以及胃腸道各段組織中均有表達(dá)。經(jīng)對(duì)FcRn/GAPDH電泳條帶密度掃描分析，仔豬胃腸道中以十二指腸后段和空腸前段表達(dá)量最高，在十二指腸和空腸段，從一出生就有較高水平的FcRn轉(zhuǎn)錄，吮乳后至出生后1d達(dá)劍峰值，4d后Fc

4、RnmRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯降低(P<0.05)，至斷奶時(shí)降劍最低?；啬c段FcRn表達(dá)水平較十二指腸和空腸段低，表達(dá)量變化不明顯。胃與結(jié)腸部位FcRn的表達(dá)最低，且不同日齡問(wèn)表達(dá)比較穩(wěn)定。FcRn在仔豬十二指腸后段和空腸前段的高表達(dá)水平提示仔豬十二指腸、卒腸是FcRn轉(zhuǎn)運(yùn)初乳中IgG的主要部位。 2.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)仔豬肝臟和胃腸道組織中FcRn的表達(dá)進(jìn)行了定量檢測(cè)。根據(jù)GenBank公布的豬FcRn重鏈mRNA基因保

5、守序列臼行設(shè)計(jì)PCR引物和熒光探針，并以B-actin為管家基因，建立測(cè)定仔豬FcRn mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)cRn在仔豬體內(nèi)不同組織中表達(dá)水平有顯著差異。其中，在肝臟中表達(dá)水平最高(ΔCt=4.95)；其次是在十二指腸遠(yuǎn)端和空腸近端；十二指腸近端和空腸遠(yuǎn)端的表達(dá)量次之；在仔豬同腸和結(jié)腸部位均為低表達(dá)，且表達(dá)量極為接近：FcRn在仔豬胃內(nèi)也有表達(dá)，但表達(dá)量最低(ΔCt=6.91)。FcRn mRNA表達(dá)量

6、隨日齡的變化規(guī)律為：出生當(dāng)天表達(dá)水平較低，未吃初乳(0w)和已吃初乳(Oy)沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；1d時(shí)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，隨后維持在較穩(wěn)定的水平直至21d時(shí)有所下降；28d時(shí)FcRn在胃腸道各部位表達(dá)均有顯著升高(P<0.05)；35d時(shí)則普遍回落到與前期相近的水平。 3.建立了檢測(cè)仔豬小腸FeRn表達(dá)的地高辛標(biāo)記探針原位雜交方法。根據(jù)GenBank公布的豬FcRn重鏈(α鏈)mRNA基因保守序列設(shè)計(jì)并合

7、成帶地高辛標(biāo)記的原位雜交試驗(yàn)用cDNA探針。經(jīng)仔豬小腸冰凍組織切片最佳厚度選擇，以及H2O2溶液祛除小腸組織中內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶作用對(duì)雜交結(jié)果的影響，選擇合適的固定劑、細(xì)胞膜蛋白消化劑、雜交液和確定雜交反應(yīng)的溫度、時(shí)間以及雜交后處理等一系列試驗(yàn)條件優(yōu)化，建立了檢測(cè)仔豬小腸FcRn mRNA的原位雜交方法。結(jié)果顯示，原位雜交的最佳反應(yīng)條件為：冰凍組織切片厚度為14 μm；固定液采用4％多聚甲醛溶液，固定時(shí)間為1h；雜交前用1％的Trit

8、on X-100處理切片15 min采用含有50％去離子甲酰胺的Yeast RNA雜交液，每張切片滴加30μL～50μL；探針濃度為1.5 μg/mL雜交溫度為46.8℃，時(shí)間為18h；與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體(anti-DIG-HRP)于4℃作用16h后，用DAB顯色10～15 min；切片最后用蘇木素染色液復(fù)染。 4.應(yīng)用原位雜交方法研究了FcRn mPNA在仔豬小腸各段的表達(dá)分布特點(diǎn)，并利用相應(yīng)軟件進(jìn)行了表達(dá)量分

9、析。結(jié)果表明，在仔豬十二指腸、空腸和同腸組織的小腸上皮細(xì)胞和黏膜下層等部位均檢測(cè)到清晰的雜交信號(hào)。其中，在小腸黏膜上皮檢測(cè)到大量的FcRn mRNA陽(yáng)性信號(hào)，尤其是空腸部位表達(dá)信號(hào)最強(qiáng)，其次是十二指腸遠(yuǎn)端，而在十二指腸近端和同腸段表達(dá)信號(hào)相對(duì)較弱；而小腸黏膜固有層的陽(yáng)性信號(hào)主要集中在固有層內(nèi)小血管周圍，且以空腸部位為主；在十二指腸、空腸和同腸部位的黏膜下層均檢測(cè)到FcRn mRNA陽(yáng)性信號(hào)，其中在空腸黏膜卜層表達(dá)最強(qiáng)。仔豬FcRn的表達(dá)

10、動(dòng)態(tài)為：出生3d內(nèi)FcRn在仔豬十二指腸、空腸和回腸部位均為高表達(dá)，3d時(shí)出現(xiàn)顯著下降，隨后表達(dá)水平基本穩(wěn)定，直至21d后才出現(xiàn)回升。其中，十二指腸部位從仔豬一出生即高表達(dá)FcRn，而同腸部位FcRn的表達(dá)從3d開(kāi)始直至斷奶后一直維持在低水甲。 5.進(jìn)行了仔豬血清IgG水平動(dòng)態(tài)的檢測(cè)，并分析了與小腸FcRn表達(dá)的相關(guān)性。利用放射免疫測(cè)定(RIA)檢測(cè)了從初生劍斷奶階段仔豬血液免疫球蛋白IgG的水平及其變化動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明，在山生后

11、2d內(nèi)仔豬血液IgG抗體水平的變化與小腸FcRn表達(dá)量具有高度相關(guān)性，提示FcRn在新生仔豬腸道轉(zhuǎn)運(yùn)IgG過(guò)程中的主要作用。其中在仔豬剛出生時(shí)IgG含量為0，吸吮初乳后(0.5d)水平迅速上升，至1d時(shí)達(dá)到峰值，而在3d時(shí)IgG水平山現(xiàn)急劇下降，IgG水平在7d時(shí)達(dá)劍第2次高峰，但從10d顯著卜降隨后基本保持穩(wěn)定，至35d時(shí)血液IgG水平又出現(xiàn)大幅度升高，達(dá)到4.74.mg/mL。 對(duì)仔豬FcRn表達(dá)的定性、定位和定量檢測(cè)均表明