表達外源hEGF基因HaCaT細胞生物學(xué)特性及其誘導(dǎo)皮膚附件轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、【研究背景】
　　大面積深度燒傷后，由于供皮區(qū)缺乏，導(dǎo)致創(chuàng)面修復(fù)困難[1]，給患者留下了嚴重的傷殘。為此，人們在解決大面積燒傷后皮源短缺的問題上已經(jīng)探索了很長時間，然而傳統(tǒng)的方法，比如：自體網(wǎng)狀皮、大張異種皮開窗嵌入自體微型皮片、微粒皮以及自體表皮細胞培養(yǎng)擴增后移植等雖然一定程度上解決了一些問題，但是這些方法面臨著一個共同的不足：不同程度的瘢痕形成致外觀不佳、畸形嚴重致功能障礙等[2-5]。對此，近年來人們開始構(gòu)建組織工程學(xué)皮膚以

2、期望解決這個問題，從最初由Burk和Yannas設(shè)計的人工真皮到現(xiàn)在美國FDA批準用于臨床的含有人體活細胞皮膚替代品Apligraf的發(fā)展，證明了構(gòu)建組織工程皮膚的可行性，雖然這些產(chǎn)品還面臨一些缺點：缺少汗腺及毛囊等皮膚附屬器官（附件）而難以獲得正常皮膚所應(yīng)具有的外觀及生理功能[6]。大面積深度燒傷病人修復(fù)創(chuàng)面無毛發(fā)，尤其是無汗腺，則不僅影響美觀，更嚴重地影響創(chuàng)面愈合后的生活質(zhì)量；因此，重建皮膚附件已成為皮膚組織修復(fù)領(lǐng)域的重要課題。本課

3、題以表皮干細胞（ESC）為種子細胞，鼠尾膠原作為支架材料，借助對皮膚附件汗腺及毛囊形成有重要誘導(dǎo)效應(yīng)的表皮生長因子（由本實驗室構(gòu)建的hEGF基因轉(zhuǎn)染HaCaT細胞分泌）及真皮成纖維細胞和脂肪干細胞，作為ESC增殖分化的因子，構(gòu)建組織工程皮膚。以探索人體ESC分化為皮膚附件汗腺、毛囊的可能性，并分析探討其分化機制。
　　【研究目的】
　　1、觀察本實驗室已經(jīng)構(gòu)建的表達質(zhì)粒pcDNA3.1-hEGF轉(zhuǎn)染HaCaT細胞的形態(tài)學(xué)、增

4、殖、分泌EGF免疫表型等生物學(xué)特性。
　　2、探索高效分離和培養(yǎng)人ESC方法，觀察其生物學(xué)特性，并行形態(tài)學(xué)、免疫表型等鑒定。
　　3、探索不同方法、條件對構(gòu)建以ESC為種子細胞的組織工程皮膚生物學(xué)影響。
　　4、利用表皮（干）細胞復(fù)合細胞化真皮的體外培養(yǎng)模型，對皮膚附件的體外表型轉(zhuǎn)化進行探索性研究。
　　【研究內(nèi)容】
　　1、對本實驗室已經(jīng)構(gòu)建的hEGF基因轉(zhuǎn)染HaCaT細胞進行形態(tài)學(xué)、增殖、分子表型等生物

5、學(xué)特性。
　　2、分離、培養(yǎng)表皮干細胞，觀察其形態(tài)學(xué)特征、測定其增殖曲線及分子表型鑒定。
　　3、分離、培養(yǎng)脂肪干細胞，觀察形態(tài)學(xué)特征，成骨、成脂誘導(dǎo)分化，流式細胞儀分子表型鑒定。
　　4、建立穩(wěn)定的三維立體組織工程皮膚，觀察EGF對其生物學(xué)影響。
　　5、觀察外源性EGF誘導(dǎo)ESC復(fù)合組織工程真皮向汗腺轉(zhuǎn)化的趨勢。
　　【研究結(jié)果】
　　1、hEGF轉(zhuǎn)染HaCaT細胞具有高分泌EGF，HaCaT細胞

6、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGF基因后，經(jīng)分子表型鑒定，K19、整合素-β1表達量升高。
　　2、利用改良方法可獲得大量活性較高的ESC。分子表型鑒定其高表達K19、整合素-β1。
　　3、分離、培養(yǎng)ADSCs。流式細胞儀檢測CD29、CD90、CD105陽性表達；CD31、CD43、CD45陰性表達。成骨、成脂誘導(dǎo)分化后，ADSCs分別呈現(xiàn)骨細胞、脂肪細胞的表性特征。
　　4、以ESC作為種子細胞，鼠尾膠原為支架，EGF作為生長因子構(gòu)

7、建三維組織工程皮膚，組織切片顯示其分為三層，具有皮膚組織的基本特點。
　　5、構(gòu)建組織工程皮膚經(jīng)RT-PCR檢測，其汗腺細胞表面抗原CK19、CEA的mRNA水平上升。
　　【研究結(jié)論】
　　1、hEGF轉(zhuǎn)染HaCaT細胞具有高效穩(wěn)定分泌EGF，分子表型鑒定hEGF轉(zhuǎn)染HaCaT細胞具有表皮細胞的一般生物學(xué)特性。
　　2、利用改良、分離培養(yǎng)方法可獲得大量活性較高的ESC，具有ESC的一般生物學(xué)特性。
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