奧利亞羅非魚DMO和DMT基因的克隆及分子生物學(xué)特征和功能分析.pdf

1、羅非魚是原產(chǎn)于非洲的熱帶魚類，現(xiàn)已成為世界性的主要養(yǎng)殖魚類。在生產(chǎn)上，羅非魚雄魚比雌魚生長(zhǎng)快40-50％，因此提高羅非魚雄性率具有重要實(shí)踐意義。在各種羅非魚雜交組合中，奧尼雜交魚的雄性率最高，為95％，但根據(jù)染色體決定性別理論，其雄性率應(yīng)為100％。由于魚類的性別決定機(jī)制是多樣的和易變的，較高等動(dòng)物要復(fù)雜得多，因而通過(guò)分子生物學(xué)的研究從基因水平進(jìn)行探討，是一條揭示羅非魚性別控制機(jī)理的好途徑，為進(jìn)一步提高羅非魚雄性率奠定基礎(chǔ)。本研究利用R

2、T-PCR和RACE方法克隆了奧利亞羅非魚的DMO和DMT基因，并對(duì)它們的表達(dá)特性進(jìn)行了研究，這將有助于了解奧利亞羅非魚的性別決定機(jī)制，從而采取人為控制措施，對(duì)奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚雜交產(chǎn)生全雄雜交后代的理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐具有重要意義。 利用RT-PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增法分別從奧利亞羅非魚卵巢和精巢分離、克隆DMO和DMT基因，并進(jìn)行序列測(cè)定與生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，DMO基因cDNA序列全長(zhǎng)1571 bp[不含pol

3、y(A)]，包括148 bp 5’非翻譯區(qū)，1230 bp閱讀框以及含Poly(A)信號(hào)AATAAA的193 bp3’非翻譯區(qū)[不包括Poly(A)]，閱讀框共編碼409個(gè)氨基酸，與尼羅羅非魚DMO進(jìn)行比較，同源性為96.3％，說(shuō)明DMO在同物種間差別較小。而與尼羅羅非魚，紅鰭東方豚，虹鱒，青鯔，鼠，人等動(dòng)物的DMRTl進(jìn)行比較，同源性分別為：25.7％，25.8％，24.3％，29.7％，22.5％，22.0％。DMT基因cDNA序列

4、全長(zhǎng)1260 bp，包括74 bp 5’非翻譯區(qū)，879 bp閱讀框以及含poly(A)信號(hào)AATAAA的307 bp 3’非翻譯區(qū)，閱讀框共編碼292個(gè)氨基酸。序列同源性分析表明，不同進(jìn)化地位動(dòng)物的DMRT1基因DM域編碼序列存在高度同源性，顯示DMRT1基因在系統(tǒng)進(jìn)化上高度保守。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，DMO蛋白具有兩個(gè)親水性螺旋卷曲區(qū)域，97～112，155～168氨基酸區(qū)域，沒(méi)有信號(hào)肽，含有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，發(fā)生跨膜運(yùn)動(dòng)。DMT蛋

5、白不含螺旋卷曲區(qū)域，沒(méi)有信號(hào)肽，是一個(gè)非跨膜的親水性穩(wěn)定蛋白，該蛋白以游離形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，不會(huì)發(fā)生跨膜運(yùn)動(dòng)。DMO和DMT包含兩個(gè)相同的保守的功能結(jié)構(gòu)域，分別行使性別調(diào)控，使DNA形成二聚體和結(jié)合回紋結(jié)構(gòu)的功能。DMO和DMT都含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)它們可能在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用，且其生物活性可能接受信號(hào)途徑中多種信號(hào)的調(diào)控。DMO蛋白N-端第1～5，41～51，65～67，86～89，98～110，154～170，183～20

6、3，205～248，258～264，284～291，293～298，270～375，389～392，402～410區(qū)域和DMT蛋白N-端第1～9，17～28，77～84，114～123，131～139，157～184，196～207區(qū)域可能是B細(xì)胞表位優(yōu)勢(shì)區(qū)域。DMO和DMT的高級(jí)結(jié)構(gòu)相似，都含有兩個(gè)a-螺旋區(qū)域。采用熒光定量RT-PCR方法，從mRNA水平對(duì)奧利亞羅非魚DMO和DMT基因的時(shí)空表達(dá)譜進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)基因均從

7、原腸胚早期開始轉(zhuǎn)錄，一直到出膜，都維持著較高的表達(dá)水平，但DMO表達(dá)量明顯高于DMT。魚苗性腺分化時(shí)期，激素處理可顯著提高奧利亞羅非魚的雌、雄比率，還可影響DMO和DMT基因的表達(dá)量，提示它們可能與激素調(diào)控有關(guān)。在雌、雄魚的肝和腎等5種組織中均檢測(cè)不到這兩個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本的存在；在腦中僅可檢測(cè)到DMO基因不同強(qiáng)弱的轉(zhuǎn)錄本，呈現(xiàn)出很強(qiáng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)特異性。此外，在成體的卵巢和精巢中分別只可檢測(cè)到DMO和DMT基因的大量表達(dá)，顯示二者在性

8、別決定和分化中的重要功能。奧利亞羅非魚DMO基因在其中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及卵巢發(fā)生和功能維持上有著重要功能；DMT基因在精巢發(fā)生和功能維持上起重要作用。 為了進(jìn)一步分析這兩種基因mRNA在胞內(nèi)的表達(dá)情況，利用原位雜交分析了奧利亞羅非魚端腦、下丘腦、垂體、性腺、肝臟、心臟、脾臟、腎臟、肌肉等組織中DMO和DMTmRNA的表達(dá)情況，結(jié)果表明：DMO只在奧利亞羅非魚的卵巢中表達(dá)；DMT僅在其精巢中表達(dá)。在奧利亞羅非魚卵子發(fā)生中，DMO m

9、RNA均勻分布于卵原細(xì)胞和各期卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中；在卵原細(xì)胞和Ⅰ、Ⅱ期卵母細(xì)胞中，隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育，DMO mRNA的雜交信號(hào)逐漸增強(qiáng)，最后充滿整個(gè)胞質(zhì)中。Ⅲ期卵母細(xì)胞中，DMO均勻分布在卵黃顆粒之間的細(xì)胞質(zhì)中。Ⅳ期以上的卵母細(xì)胞胞質(zhì)中，相對(duì)于前三個(gè)時(shí)期DMO mRNA的雜交信號(hào)明顯減弱，整個(gè)胞質(zhì)都呈現(xiàn)較淡的黃色，有向胞質(zhì)外周皮質(zhì)層遷移集中的趨勢(shì)。當(dāng)卵黃充滿整個(gè)胞質(zhì)之后，在整個(gè)卵母細(xì)胞中無(wú)DMO mRNA的雜交信號(hào)。在奧利亞羅非魚精子發(fā)

10、生中，DMT mRNA可在精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞中檢測(cè)到。DMT mRNA的陽(yáng)性信號(hào)在精原細(xì)胞中極為強(qiáng)烈，在初級(jí)精母細(xì)胞中較為微弱，而精子細(xì)胞中沒(méi)有陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)果初步表明，奧利亞羅非魚DMO和DMT基因?qū)τ谏掣杉?xì)胞．卵原細(xì)胞和精原細(xì)胞的維持和正常功能可能起著重要作用。 為了進(jìn)一步探討奧利亞羅非魚DMO和DMT的功能，本研究采用RT-PCR方法分別從奧利亞羅非魚卵巢和精巢中克隆出DMO和DMT全長(zhǎng)cDNA片斷，構(gòu)建了pMAL-c

11、2x/DMO和pMAL-c2x/DMT重組質(zhì)粒，成功地表達(dá)了DMO和DMT蛋白，發(fā)現(xiàn)在IPTG誘導(dǎo)4h后，目的蛋白可達(dá)到細(xì)菌總蛋白的50％左右。同時(shí)通過(guò)免疫印跡技術(shù)證明了這兩種蛋白的免疫原性。經(jīng)Xa切割、Aanylose-sepharose柱層析純化后作為抗原免疫新西蘭白兔制備了DMO和DMT多克隆抗體，并進(jìn)行純化。通過(guò)對(duì)純化多抗進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明獲得了高特異性的DMO和DMT抗體。 為了觀察DMO和DM

12、T在組織中的表達(dá)譜，首先，本研究制備了多種組織勻漿蛋白，使用純化的抗體進(jìn)行Westem blot分析，僅分別在卵巢和精巢中檢測(cè)到DMO和DMT蛋白的表達(dá)；制備奧利亞羅非魚多種組織切片，使用純化的DMO和DMT多抗進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)DMO僅在卵巢表達(dá)，而DMT僅在精巢表達(dá)，但其特異性低于原位雜交。以上結(jié)果有助于闡明DMO和DMT的功能及在魚類性別調(diào)控中的作用。本研究首次從奧利亞羅非魚中克隆到性別調(diào)控基因DMO和DMT，并分析了它們