小鼠髕腱干細(xì)胞分化過(guò)程中的力學(xué)特性研究.pdf

1、細(xì)胞作用于細(xì)胞外基質(zhì)的力稱(chēng)為細(xì)胞牽引力(Cell Traction Force)。它由肌動(dòng)球蛋白的相互作用和肌動(dòng)蛋白的聚合作用而產(chǎn)生。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞牽引力受α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的調(diào)節(jié)，細(xì)胞牽引力具有促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)，感受細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，維持細(xì)胞形狀，產(chǎn)生傳導(dǎo)信號(hào)，維持細(xì)胞生理特性等功能。細(xì)胞牽引力是細(xì)胞的一個(gè)重要物理參數(shù)，它與細(xì)胞的許多生物過(guò)程有著密切的關(guān)系，比如炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷修復(fù)、血管生成、信號(hào)傳導(dǎo)等等。研究細(xì)胞牽引力可使人們

2、更完整地認(rèn)識(shí)細(xì)胞及其生長(zhǎng)發(fā)育的變化機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定小鼠髕腱組織的干細(xì)胞分化前后細(xì)胞牽引力的變化，研究細(xì)胞牽引力在干細(xì)胞分化過(guò)程中的變化規(guī)律。
　　目的：通過(guò)測(cè)量小鼠髕腱組織干細(xì)胞在分化前和分化后不同形態(tài)時(shí)的細(xì)胞牽引力，去探明小鼠髕腱干細(xì)胞在分化的整個(gè)過(guò)程中的細(xì)胞牽引力的變化規(guī)律，更深入的了解細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的變化規(guī)律，對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)更進(jìn)一步的了解和認(rèn)識(shí)。
　　方法和結(jié)論：細(xì)胞培養(yǎng)。小鼠髕腱干細(xì)胞獲取后置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)

3、，培養(yǎng)三至四天換液，去除未貼壁的細(xì)胞。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，挑取克隆生長(zhǎng)的干細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，每三天傳代一次，待大多數(shù)細(xì)胞具有較好的集落形態(tài)時(shí)，應(yīng)用CTFM(Cell Traction Force Microscopy)法測(cè)定細(xì)胞牽引力。CTFM即顯微鏡追蹤法測(cè)定細(xì)胞牽引力技術(shù)。其基本原理是根據(jù)細(xì)胞基質(zhì)彈性表面形變來(lái)測(cè)算細(xì)胞牽引力的一種技術(shù)。根據(jù)細(xì)胞的大小不同置備不同硬度的彈性基質(zhì)，在制備彈性基質(zhì)時(shí)摻入熒光微珠，以確定基質(zhì)的形變程度

4、。測(cè)定細(xì)胞牽引力時(shí)，將細(xì)胞移種在彈性基質(zhì)表面，當(dāng)細(xì)胞貼附后會(huì)使基質(zhì)產(chǎn)生形變，此時(shí)先用熒光顯微鏡的普通光源拍攝細(xì)胞貼附到基質(zhì)上的細(xì)胞圖片，再用熒光光源拍攝基質(zhì)圖片，用1M的NaOH殺死細(xì)胞，使細(xì)胞脫離基質(zhì)表面，此時(shí)彈性基質(zhì)將回復(fù)原位，再拍攝一張恢復(fù)原位的基質(zhì)圖片。將細(xì)胞脫離前后的基質(zhì)形態(tài)變化圖片，用MATLAB7.0專(zhuān)用自編程序進(jìn)行比較分析即可測(cè)算出細(xì)胞牽引力。
　　Western bloting技術(shù)測(cè)定小鼠髕腱干細(xì)胞分化前后α-S

5、MA的含量表達(dá)。小鼠髕腱干細(xì)胞分化以后，當(dāng)形態(tài)上有了明顯的變化形成成纖維細(xì)胞以后，其細(xì)胞牽引力會(huì)明顯減小，平均減小30％左右；與此同時(shí)α-SMA的含量也發(fā)生了相應(yīng)的變化。小鼠髕腱干細(xì)胞分化后細(xì)胞牽引力的減小表明干細(xì)胞在分化過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)的分子結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生了顯著變化，尤其是α-SMA的含量發(fā)生了變化。這說(shuō)明在分化過(guò)程當(dāng)中，隨著分化過(guò)程的進(jìn)行，α-SMA的基因表達(dá)受到了一定程度的限制。
　　熒光抗體技術(shù)檢測(cè)蛋白。利用間接熒光染色法檢測(cè)