Tg737基因在胎肝干細(xì)胞分化過(guò)程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、胎肝干細(xì)胞具有能分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的特點(diǎn),為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用搭建了更寬闊的平臺(tái),干細(xì)胞治療各類(lèi)肝臟疾病的構(gòu)想和實(shí)踐與再生醫(yī)學(xué)的理念不謀而合,其前景是光明遠(yuǎn)大的。同時(shí)大量的研究表明干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞有著微妙的聯(lián)系,干細(xì)胞的分化異?？赡軐?dǎo)致惡變,甚至引發(fā)腫瘤。因此,正反兩個(gè)方面都說(shuō)明了探究胎肝干細(xì)胞正常分化過(guò)程中受到哪些關(guān)鍵分子、蛋白抑或信號(hào)通路的調(diào)控及其潛在機(jī)制的重要性和必要性。
　　目的:
　　本研究以胎肝干細(xì)胞的

2、正常分化為切入點(diǎn),擬初步探索Tg737基因在胎肝干細(xì)胞分化過(guò)程中所起的作用及其潛在的分子機(jī)制。研究?jī)?nèi)容分為兩部分:1、Tg737基因在胎肝干細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)及作用;2、初步探討Tg737基因調(diào)控胎肝干細(xì)胞分化的機(jī)制。
　　方法:
　　1.三步分離法收集胎肝干細(xì)胞;HGF(20ng/ml)誘導(dǎo)胎肝干細(xì)胞一周,選取第1、3、5、7天定為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)點(diǎn),PCR連續(xù)監(jiān)測(cè)ALB和AFP的mRNA表達(dá)變化;在上述4個(gè)時(shí)間點(diǎn),Wes

3、tern blot連續(xù)監(jiān)測(cè)Tg737蛋白的表達(dá)變化;慢病毒Tg737-shRNA轉(zhuǎn)染胎肝干細(xì)胞,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,PCR、Western blot檢測(cè)沉默效果;流式細(xì)胞術(shù)連續(xù)檢測(cè)兩組細(xì)胞的CD133表達(dá)變化;PCR連續(xù)監(jiān)測(cè)兩組細(xì)胞ALB和AFP的表達(dá)變化;在培養(yǎng)第7天,透射電鏡觀察兩組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)差異。
　　2.PCR、Western blot連續(xù)監(jiān)測(cè)HNF4α在正常胎肝干細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化;在培養(yǎng)第7天以Western

4、 blot、PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中HNF4α蛋白和mRNA的表達(dá)情況;免疫熒光技術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)情況;Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞中Snail蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.三步分離法能有效富集胎肝干細(xì)胞;在HGF(20ng/ml)誘導(dǎo)正常胎肝干細(xì)胞的第1、3、5、7天,AFP的mRNA表達(dá)逐漸降低,ALB的mRNA表達(dá)逐漸升高;在誘導(dǎo)分化過(guò)程中,Tg737的蛋白表達(dá)逐漸升高;慢

5、病毒-shRNA能有效下調(diào)Tg737的mRNA和蛋白表達(dá);在HGF誘導(dǎo)分化過(guò)程中,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞CD133的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在第1天,二者的表達(dá)無(wú)顯著差異,隨著誘導(dǎo)的進(jìn)行,相比對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組CD133表達(dá)的下降更緩慢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);實(shí)驗(yàn)組AFP和ALB的mRNA水平均無(wú)明顯變化(p>0.05);在第7天以透射電鏡觀察兩組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu):實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞核大且富含異染色質(zhì),胞質(zhì)稀疏且細(xì)胞器極少,核質(zhì)比大,細(xì)胞表面絨毛的

6、數(shù)量稀少;對(duì)照組細(xì)胞的核質(zhì)比很低,細(xì)胞都已極化,細(xì)胞質(zhì)中含有大量的線粒體、溶酶體、發(fā)育良好的高爾基體等細(xì)胞器,顯示出早期分化的特點(diǎn)。
　　2.在HGF(20ng/ml)誘導(dǎo)正常胎肝干細(xì)胞分化的第1、3、5、7天,PCR、Western blot連續(xù)監(jiān)測(cè)提示:HNF4α的mRNA和蛋白水平都逐漸增加(p<0.05);相比對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組HNF4α的mRNA和蛋白水平都顯著下調(diào)(p<0.05),核內(nèi)的β-catenin表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫反

7、應(yīng)性即Wnt/β-catenin呈過(guò)度激活表現(xiàn),Snail蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.三步分離法能有效富集胎肝干細(xì)胞,HGF(20ng/ml)能有效誘導(dǎo)胎肝干細(xì)胞向正常肝細(xì)胞分化。
　　2.Tg737基因參與調(diào)控胎肝干細(xì)胞向正常肝細(xì)胞的分化,抑制Tg737的表達(dá)導(dǎo)致胎肝干細(xì)胞分化受阻。
　　3.HNF4α參與胎肝干細(xì)胞的正常分化過(guò)程;Tg737基因的缺失導(dǎo)致HNF4α表達(dá)下調(diào),Wnt/β-catenin信