候選基因LBC在雞精原干細(xì)胞形成過(guò)程中的作用研究.pdf

1、精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是雄性成體干細(xì)胞中唯一一種能夠?qū)⑦z傳物質(zhì)傳遞給下一代的干細(xì)胞。SSCs作為生殖干細(xì)胞，是精子發(fā)生的基礎(chǔ)，在研究精子發(fā)生機(jī)制、闡述男性不育病因和治療男性不育癥等領(lǐng)域有著不可替代的作用。精原干細(xì)胞的形成受到相關(guān)基因的調(diào)控，但是其具體分子機(jī)制現(xiàn)在仍然未知。本研究針對(duì)精原干細(xì)胞上特異表達(dá)候選基因LBC進(jìn)行功能驗(yàn)證，以如皋黃雞作為試驗(yàn)動(dòng)物，在體外和體內(nèi)通過(guò)敲除和過(guò)表達(dá)LBC

2、基因的方法，研究LBC基因在雞精原干細(xì)胞形成過(guò)程中的作用，為闡明精原干細(xì)胞發(fā)生及分化機(jī)制提供參考。
　　本文主要研究如下:
　　1.如皋黃雞LBC基因的克隆根據(jù)NCBI提供的LBC基因序列，設(shè)計(jì)引物克隆LBC基因的CDS區(qū)，并將其連接至pMD19-T載體中進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明pMD19-T-LBC構(gòu)建正確，與公布的原雞LBC基因CDS區(qū)同源性達(dá)99.43％，編碼氨基酸有兩個(gè)發(fā)生改變，成功克隆出如皋黃雞中LBC基因，可用于后

3、續(xù)研究。
　　2.LBC基因多克隆抗體制備及亞細(xì)胞定位研究制備LBC基因的抗原多肽，注射小鼠進(jìn)行免疫，收集血清后通過(guò)間接免疫熒光技術(shù)(IFA)進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè);構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-LBC，轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞48 h后于熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果，并利用RT-PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定LBC-eGFP mRNA和蛋白水平的表達(dá)狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RT-PCR能檢測(cè)到融合蛋白轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，熒光顯微鏡觀察和IFA檢測(cè)

4、結(jié)果都顯示LBC-eGFP融合蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá)，與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。
　　3.LBC基因?qū)杉?xì)胞形成的影響構(gòu)建LBC敲除載體CRISPR/Cas9-LBC和過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.0-LBC，轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后利用測(cè)序、T7E1酶切和Western Blot技術(shù)驗(yàn)證載體活性;分別轉(zhuǎn)染ESC，在RA誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用形態(tài)學(xué)觀察、免疫化學(xué)檢測(cè)和QRT-PCR等方法在體外檢測(cè)LBC缺失與過(guò)表達(dá)對(duì)ESC向SS

5、C分化的影響，同時(shí)雞胚注射CRISPR/Cas9-LBC和pcDNA3.O-LBC載體，采用石蠟切片和流式分析的方法在體內(nèi)檢測(cè)LBC缺失與過(guò)表達(dá)對(duì)PGCs和SSCs形成的影響。結(jié)果表明CRISPR/Cas9-LBC和pcDNA3.0-LBC載體均構(gòu)建成功且具有活性;體外實(shí)驗(yàn)中，與RA誘導(dǎo)組相比，LBC過(guò)表達(dá)顯著地促進(jìn)了ESC向SSC的分化，且integrinα6、integrinβ1等SSCs標(biāo)記基因的表達(dá)量也有顯著的增加，在第10天，

6、相對(duì)于誘導(dǎo)組中integrinα6的相對(duì)表達(dá)量(1.96)，在過(guò)表達(dá)組中達(dá)到2.34;相反的，LBC敲除，ESCs向SSCs的分化受到一定程度的抑制，第6天克隆形成之后，不能形成精原樣細(xì)胞，且全能性標(biāo)記基因Sox2的表達(dá)量的降低受到抑制，相對(duì)于誘導(dǎo)組中相對(duì)表達(dá)量(0.96)，在敲除組中達(dá)到1.03，integrinα6、integrinβ1表達(dá)量也相對(duì)減少;體內(nèi)試驗(yàn)中，與正常發(fā)育的雞胚相比，LBC過(guò)表達(dá)顯著的促進(jìn)了PGC和SSC細(xì)胞的生