microRNAs在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過程中的差異表達及其對毛細胞分化的作用研究.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文micrNAs在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過程中的差異表達及其對毛細胞分化的作用研究姓名：王仙仁申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：耳鼻咽喉科學(xué)指導(dǎo)教師：姜鴻彥20100520中山大學(xué)博士論文microRNAs在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過程巾的差異表達及其對毛細胞分化的作用研究Mathl，Jagged2，p27鼬p1，F(xiàn)actin。掃描電鏡觀察分化前后細胞形態(tài)。從C57BL／6鼠肝臟中提取基因組DNA，擴增包含miR183家族成員的PCR產(chǎn)物，并定向插入

2、腺病毒穿梭載體pAdTrackCMV。將經(jīng)pineI線性化的重組穿梭載體與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy1共轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，通過同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAdmiR182、pAdmiR183、pAdmiR96。將pAdmiR在人胚腎293細胞(HEK293)中包裝并擴增出pAdmiR的重組腺病毒。從基因組DNA中擴增預(yù)測靶基因3UTRPCR產(chǎn)物，定向插入pRLTK載體。用pAdTrackCMVmiR、pRLTKutr、p

3、GLetl共轉(zhuǎn)染COS2細胞，雙熒光素酶法檢測雙熒光強度。qRTPCR法檢測內(nèi)耳前體干細胞誘導(dǎo)分化前后miR—182表達，轉(zhuǎn)染miR182重組腺病毒、miR182抑制劑，觀察其對內(nèi)耳前體干細胞分化的影響，熒光免疫法檢測轉(zhuǎn)染前后Tbxl表達量。研究結(jié)果：miRNA芯片檢測了560個鼠miRNA，在耳蝸中有表達的有100多個，與E135dpc內(nèi)耳表達的miRNA相比較，E165dpc有I／3表達量有變化，有56個miRNA表達差異在2倍以上

4、。miR140在耳泡形成期開始表達，先在kolliker器，Corti器，螺旋神經(jīng)節(jié)，前庭上均有表達，后特異性的表達在內(nèi)外毛細胞，前庭毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)上。qRTPCR檢測結(jié)果證實miR140在內(nèi)耳表達逐漸減少。miR182與miR140表達規(guī)律相似。耳泡體外分離培養(yǎng)3天后可以形成2種球，一種是實體球，一種空心球。RTPCR顯示未分化的球主要表達Abc92，nestin等干細胞Marker，分化后的球表達mathI，myosinIIVa

5、等毛細胞Marker。免疫熒光證實，細胞球分化后表達mathl，myosinIIVa，細胞表面可見纖毛樣結(jié)構(gòu)。限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序結(jié)果顯示，重組腺病毒穿梭載體pAdTrackCMVmiR構(gòu)建正確，pRL—TKutr構(gòu)建正確。在HEK293細胞中成功包裝并擴增出重組腺病毒rAdmiR183、rAdmiR一182、rAd—miR96。雙熒光素酶報告系統(tǒng)證實Tbxl是miR182的靶基因之一。內(nèi)耳前體干細胞增殖期miR—182表達量改