BMP-2誘導牙髓細胞分化過程中的microRNAs表達譜的研究.pdf

1、一定條件的刺激下，牙髓細胞可以向成牙本質(zhì)細胞方向分化，骨形態(tài)發(fā)生蛋-2（BMP-2）在這一過程中發(fā)揮著關鍵作用。MicroRNAs作為一類具有調(diào)控功能的微小RNA，廣泛存在于哺乳動物和人類細胞中，這類小片段非編碼RNA在基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。本研究的目的旨在篩選出BMP-2誘導牙髓細胞牙向分化的miRNA標志物，確定部分差異表達的miRNA。
　　目的:
　　1、體外分離培養(yǎng)和鑒定人牙髓細胞，建立穩(wěn)定的人牙髓細胞的培養(yǎng)。

2、
　　2、用BMP-2誘導牙髓細胞，并對誘導后的牙髓細胞進行成牙本質(zhì)鑒定，以探究BMP-2誘導人牙髓細胞的適宜條件。
　　3、通過miRNAs芯片篩選出BMP-2誘導人牙髓細胞成牙本質(zhì)分化過程中，差異表達的miRNAs，并用熒光定量PCR進行驗證，進而豐富miRNAs對BMP-2誘導牙髓細胞分化調(diào)控機制的了解。
　　方法:
　　1、人牙髓細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定:收集新鮮拔除、無牙體及牙周疾病的正畸牙或智齒，無菌條

3、件下劈開牙冠取出牙髓，加入0.25％的胰蛋白酶，邊剪邊消化后，將牙髓組織放入培養(yǎng)瓶中，加入含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于常規(guī)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長融合至瓶底80％-90％后，消化傳代細胞，并行波形絲蛋白和角蛋白免疫細胞化學染色，取穩(wěn)定培養(yǎng)的4-6代牙髓細胞待用。
　　2、BMP-2誘導牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞分化:用不同濃度的BMP-2（濃度分別為50、100、150ng/ml），誘導體外培養(yǎng)的人牙髓細胞，檢測BMP-

4、2誘導實驗組和空白組（不含BMP-2的常規(guī)DMEM培養(yǎng)基）細胞ALP、DMP-1、DSPP基因的表達，從而初步探究BMP-2誘導人牙髓細胞的適宜濃度。
　　3、BMP-2誘導牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞分化過程中miRNAs表達譜的獲得:將誘導的牙髓細胞和空白組細胞送檢生物公司，獲得誘導細胞miRNAs差異表達譜，篩選差異表達明顯的miRNAs，并用熒光定量PCR驗證，預測差異表達miRNAs的靶基因和功能，進而探究和豐富miRNAs對

5、牙髓細胞分化調(diào)控機制的了解。
　　結果:
　　1、人牙髓細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定:(1)牙髓組織培養(yǎng)3-5天后，可見有牙髓細胞爬出，形態(tài)多為梭形、纖維狀，胞漿豐富，胞核位于細胞中央，呈橢圓形。10天左右細胞生長融合至瓶底的90％。(2)傳代后的細胞穩(wěn)定生長，大小相似，密集排列，鏡下可見細胞生長有一定的極性，6天左右細胞可以經(jīng)消化進行傳代。(3)經(jīng)細胞免疫化學染色可見，細胞波形絲蛋白陽性表達，角蛋白陰性表達，結果說明培養(yǎng)的細胞來

6、源于中胚層。
　　2、BMP-2誘導牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞分化:用不同濃度的BMP-2誘導液（BMP-2濃度分別為50ng/ml、100ng/mL、150ng/mL）誘導牙髓細胞一定天數(shù)后，牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞方向分化，RT-PCR檢測誘導組和空白組細胞目的基因的表達量得知，BMP-2誘導牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞分化的適宜濃度為100ng/ml。
　　3、BMP-2誘導牙髓細胞分化miRNAs表達譜的獲得:將細胞樣品送檢生物

7、公司，獲得差異的miRNAs表達譜，可見約52條miRNAs發(fā)生了明顯的改變，其中，上調(diào)23條，下降29條。挑選其中5條（上調(diào)3條，下調(diào)2條），利用熒光定量PCR，驗證miRNAs芯片的可信性。利用生物信息學軟件預測相關靶基因和功能。
　　結論:
　　1、利用改良酶消化法培養(yǎng)人牙髓細胞，可以獲得穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的細胞。
　　2、成功探究BMP-2誘導牙髓細胞的適宜濃度，豐富了BMP-2對牙髓細胞作用的認識。
　　3、