Hermap基因?qū)t細胞分化發(fā)育過程中細胞信號轉(zhuǎn)導通路的作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　 本課題組的前期研究顯示：①hermap基因高度特異地表達于K562、HEL細胞系，以及胎兒肝臟和骨髓、成人骨髓等造血組織；②在阿糖胞苷誘導K562細胞向紅細胞系方向分化的過程中，hermap基因的表達量逐漸增加，而在十二氟波酯鈉鹽誘導K562細胞向巨噬系方向分化的過程中，hermap基因的表達量卻無變化；③以含hermap－siRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細胞后，可抑制AraC誘導 K562細胞向紅系的分化，在此過

2、程中，hermap基因的表達量下降；④在SCF、IL-3和EPO體外誘導臍血MNCs向紅細胞系增殖分化的過程中，hermap基因的表達量逐漸升高，其趨勢與紅細胞分化發(fā)育過程一致；⑤采用Northern Blot方法研究顯示，hermap基因在25周胎兒肝臟和骨髓中表達陽性，而在胎兒脾臟、腎臟、胸腺、心臟、肺臟、大腦及肌肉中表達陰性。進一步以FQ-PCR方法研究顯示，hermap基因在胎兒肝臟中表達是從第12周開始升高，18～20周達高峰

3、，21周后開始下降并穩(wěn)定于較低水平，與胚胎肝臟造血過程基本一致。Hermap在胎兒骨髓中的表達則從15周開始，27～32周達高峰，之后迅速下降，其表達規(guī)律與胎兒期骨髓造血過程基本一致。但妊娠32周后骨髓造血活動仍然存在，而hermap基因的表達量卻迅速下降。
　　 課題的提出：hermap基因參與紅細胞增殖分化過程中的細胞信號轉(zhuǎn)導？hermap基因編碼紅細胞跨膜蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員，高度特異地表達于K562細胞和HEL細

4、胞系以及胎兒肝臟和骨髓、成人骨髓等造血組織。根據(jù)其基因表達譜研究結果，推測hermap基因的功能可能與紅細胞系增殖分化有關，在胚胎發(fā)育過程中，可能還參與了紅系細胞向肝臟和骨髓的遷移活動。通過對其蛋白質(zhì)結構域與其它已知蛋白結構域的比較，推測hermap基因在紅細胞系增殖分化過程中，可能參與了細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導。但是，對于hermap確切的功能及其作用機理，尚未明了?；谏鲜觯菊n題擬建立上調(diào)及下調(diào)hermap基因表達的K562細胞系，并以A

5、ra-C誘導其向紅細胞分化發(fā)育，在此過程中，觀察hermap基因?qū)t細胞信號轉(zhuǎn)導通路的影響，以期找出HERMAP和紅細胞信號轉(zhuǎn)導通路之間的聯(lián)系。以期為探討hermap基因在紅細胞增殖分化過程中的作用，揭示其與紅細胞疾病的關系，并為發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控紅細胞分化發(fā)育的信號分子，提供新的依據(jù)和思路。
　　 研究目的：
　　 通過分別建立pEGFP-C1-hermap及pRNATH1.1-GFP/Neo-hermap siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)

6、染的K562細胞系，觀察上調(diào)及下調(diào)hermap基因的表達對AraC誘導K562細胞向紅細胞系分化過程中細胞信號轉(zhuǎn)導通路的影響，探討hermap基因在紅細胞分化發(fā)育過程中的作用。
　　 研究方法：
　　 1.pEGFP-C1-hermap及pRNATH1.1-GFP/Neo-hermap siRNA的構建1.1 pEGFP-C1-hermap的構建設計分別帶有BamHI和EcoRV酶切位點的上下游引物，利用RT-PCR從K

7、562細胞cDNA中擴增hermap的編碼序列，擴增片斷大小為1428bp。Hermap編碼序列插入到帶有BglII和SmaI酶切位點的pEGFP-C1載體，所構建的載體通過酶切及測序鑒定。
　　 1.2 pRNATH1.1-GFP/Neo-hermap siRNA的構建針對靶基因hermap進行設計，從中篩選出1對靶向hermap的siRNA序列，體外合成用于淬火的雙鏈DNA分子兩端各帶有BamHI和HindⅢ酶切位點，與帶有

8、相同酶切位點的載體pRNAT-H1.1-GFP連接。所構建的載體通過酶切及測序鑒定。
　　 2．pEGFP-C1-hermap和pRNATH1.1-GFP/Neo-hermap siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K562細胞的篩選采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法分別將重組pEGFP-C1-hermap質(zhì)粒及hermap-siRNA-pRNAT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入K562細胞，經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定表達hermap和hermap-siRNA的兩個K562細胞系。
　　

9、 3．AraC誘導hermap/K562細胞和hermap-siRNA/K562細胞向紅細胞分化實驗分為hermap組、hermap-siRNA組、空質(zhì)粒組及空白組，加入Ara-C后，于0h、24h、48h、72h和96h檢測hermap基因的表達量，同時，分別觀察細胞形態(tài)、聯(lián)苯胺染色陽性率、細胞表面標記、A、G 珠蛋白基因的表達量，以證實其是否向紅系分化。
　　 4．上調(diào)及下調(diào)hermap基因的表達對紅細胞分化發(fā)育過程中細胞信

10、號轉(zhuǎn)導通路的影響在Ara-C誘導上述K562細胞向紅系細胞分化的過程中，分別于0h、24h、48h、72h、96h檢測細胞信號轉(zhuǎn)導通路中關鍵磷酸化激酶p-STAT5、p-Akt、p-MAPK、p-c-Jun等的變化，并分析其與hermap基因表達量的關系。
　　 研究結果：
　　 1．構建了hermap-pEGFP及hermap-siRNA-pRNAT的真核表達載體測序結果顯示hermap-pEGFP及hermap-si

11、RNA-pRNAT真核表達質(zhì)粒所攜帶的目的基因長度分別為1428bp和55bp，其序列與hermap及設計的hermap-siRNA序列一致。
　　 2．建立了穩(wěn)定表達hermap和hermap-siRNA的兩個K562細胞系采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法將hermap-pEGFP及hermap-siRNA-pRNAT的真核表達載體轉(zhuǎn)染入K562細胞，經(jīng)G418篩選后，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光，初步證明細胞可穩(wěn)定表達hermap基因或herm

12、ap-siRNA。
　　 3．上調(diào)hermap基因的表達可促進Ara-C誘導K562細胞向紅系分化發(fā)育的過程，而下調(diào)hermap基因的表達則可遏制這一過程在Ara-C誘導過程中，K562細胞出現(xiàn)以下變化：①細胞形態(tài)：4組細胞的體積逐漸減小，核漿比例逐漸減小，胞漿染色從深藍色轉(zhuǎn)變成藍紫色或淺紅色，核染色質(zhì)逐漸濃集、皺縮。提示K562細胞逐漸向早、中、晚幼紅細胞分化；②聯(lián)苯胺染色陽性率：hermap組在Ara-C誘導后24h、48h

13、、72h和96h，細胞聯(lián)苯胺染色陽性率逐漸增加，在上述各個時點均高于其他各組；hermap-siRNA組在誘導24h，細胞聯(lián)苯胺染色陽性率無明顯變化，48h、72h、96h后，細胞聯(lián)苯胺染色陽性率逐漸增加，在上述各時點均低于其他各組；③CD235a+/CD36-、CD235a+/CD36+和CD235a-/CD36+細胞比例：在Ara-C誘導后24h、48h、72h和96h，4組上述標記陽性的細胞比例均逐漸增加，在上述各時點，herma

14、p組最高，而hermap-siRNA組最低；④A、G 珠蛋白基因表達量：hermap組在Ara-C誘導后24h、48h、72h和96h，Aγ基因的表達量逐漸增加，且在上述各個時點均高于其他各組；誘導后24h，Gγ基因的表達量無明顯變化，48h、72h、96h后，其表達量逐漸增加；hermap-siRNA組在Ara-C誘導后24h，Aγ基因的表達量無明顯變化，48h、72h和96h表達量逐漸增加，48h、96h均低于其余3組；隨著培養(yǎng)時間

15、的延長，Gγ珠蛋白基因的表達量增加。
　　 4．上調(diào)或下調(diào)hermap基因的表達可引起磷酸化激酶p-STAT5、p-c-Jun的變化隨著Ara-C誘導時間的延長，4組p-STAT5陽性細胞的比例均逐漸增加，hermap組p-STAT5陽性細胞比例與hermap基因的增加具有正相關性，其余3組均與hermap的變化無相關性；hermap組p-c-Jun陽性細胞比例也逐漸增加，與hermap基因的增加呈正相關；hermap-siRN

16、A組p-c-Jun陽性細胞比例24h達最高，其后逐漸下降，在培養(yǎng)的各個時點高于其余3組，且與hermap基因表達量具有負相關性；4組p-MAPK陽性細胞、p-Akt陽性細胞比例與hermap基因的表達量無相關性。
　　 結論：
　　 1．本研究構建了hermap-pEGFP及hermap-siRNA-pRNAT的真核表達載體。
　　 2．建立了穩(wěn)定表達hermap和hermap-siRNA的兩個K562細胞系，并

17、證實這兩種細胞系可分別穩(wěn)定表達hermap和hermap-siRNA，為進一步研究奠定了基礎。
　　 3．上調(diào)hermap基因可促進Ara-C誘導K562細胞向紅系分化發(fā)育的過程，而下調(diào)hermap基因則可遏制該過程，進一步提示hermap與紅系分化發(fā)育密切相關。
　　 4．ERMAP對紅細胞分化發(fā)育的影響可能是通過JAK/STAT5通路實現(xiàn)的。
　　 然而，在紅細胞分化發(fā)育過程的細胞信號轉(zhuǎn)導通路中，與ERMAP