細胞骨架重塑在機械牽伸誘導(dǎo)肌腱干細胞分化過程中的作用研究.pdf

1、體內(nèi)的肌腱由于經(jīng)常承受著巨大的力學(xué)載荷，損傷是很常見的。由于肌腱自身再生能力較差，恢復(fù)損傷肌腱正常的結(jié)構(gòu)和功能是運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域目前最具挑戰(zhàn)的一個問題。隨著干細胞的發(fā)現(xiàn)，特別是近年來肌腱干細胞(tendon stem cells，TSCs)的發(fā)現(xiàn)，研究者對慢性肌腱損傷的發(fā)病機制和肌腱損傷的治療修復(fù)有了新的認識。
　　和肌腱一樣，位于其內(nèi)部的TSCs也必然會承受各種力學(xué)負荷。一項體外研究發(fā)現(xiàn):TSCs的分化與加載的力學(xué)負荷強度相關(guān):適度

2、的力學(xué)牽拉牽伸刺激可以促進TSCs向肌腱細胞分化;過度的力學(xué)牽伸刺激則會導(dǎo)致TSCs向非肌腱細胞（脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞）方向分化。然而，TSCs成肌腱和非成肌腱細胞分化的調(diào)控機制尚不清楚。
　　不同的機械牽伸可以導(dǎo)致TSCs發(fā)生不同的形變。維持細胞形態(tài)對細胞的功能至關(guān)重要，而維持細胞形態(tài)的關(guān)鍵細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)是細胞骨架。細胞骨架是細胞內(nèi)部緊密聯(lián)系的不同蛋白纖維和各種調(diào)控蛋白構(gòu)成的網(wǎng)架體系，對細胞的整體結(jié)構(gòu)起到支撐作用，在細胞伸展

3、、生長、對外界環(huán)境反應(yīng)以及分化等生理過程中，均扮演著極其重要的角色。目前，人們對于細胞力學(xué)信號傳導(dǎo)的分子機制仍然缺乏較深入的認識，但是有一個普遍認同的事實就是:細胞骨架在建立細胞內(nèi)外環(huán)境的物理-化學(xué)信號聯(lián)系及轉(zhuǎn)換上起著至關(guān)重要的作用。
　　基于上述基礎(chǔ)，我們推測在機械牽伸誘導(dǎo)的TSCs分化過程中細胞骨架重塑可能發(fā)揮了重要的作用，不同的機械牽伸導(dǎo)致TSCs細胞骨架發(fā)生了不同的變化，進而誘導(dǎo)TSCs向不同的方向分化。因此，本研究將試圖

4、明確不同機械牽伸對TSCs分化及細胞骨架的影響，以及細胞骨架變化在牽拉誘導(dǎo)分化這一過程中的作用。
　　目的:
　　(1)驗證明確不同機械牽伸對TSCs分化的影響;
　　(2)觀察不同機械牽伸對TSCs細胞骨架重塑的影響;
　　(3)探討分析細胞骨架變化在牽拉誘導(dǎo)TSCs分化過程中的作用。
　　方法:
　　(1)不同機械牽伸對TSCs分化的影響:設(shè)定不同的機械牽伸條件（1HZ;牽伸強度為4％和8％;牽伸

5、累積總時間為12h，24h，60h），模擬TSCs體內(nèi)單軸循環(huán)牽伸，通過RT-PCR技術(shù)對牽伸后TSCs成腱分化相關(guān)標志基因(Colla1、Tnc、Scx)和成脂分化相關(guān)標志基因（PPARγ、LPL、ap2）的表達變化進行檢測。
　　(2)不同機械牽伸對TSCs細胞骨架重塑的影響:設(shè)定不同的機械牽伸條件(1HZ;牽伸強度為4％和8％;牽伸累積總時間為12h，24h，60h)，模擬TSCs體內(nèi)單軸循環(huán)牽伸，將牽伸后的細胞制作成細胞爬

6、片，采用F-actin免疫熒光染色以及Western blot檢測F-actin/G-actin比值來觀察不同牽伸條件下TSCs細胞骨架的變化。
　　(3)抑制細胞骨架重塑對TSCs分化的影響:篩選出Cyt-D的適用濃度，在TSCs成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)、成肌腱誘導(dǎo)牽伸，以及普通完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程中，加入Cyt-D抑制肌動蛋白聚合，破壞細胞骨架的重塑，通過定量RT-PCR和Western blot技術(shù)對Cyt-D干擾后TSCs成脂和成腱

7、分化相關(guān)標志基因、蛋白的表達變化進行檢測。
　　結(jié)果:
　　(1) Colla1、Tnc、Scx基因mRNA的表達在頻率1HZ，4％的牽拉應(yīng)力載荷時，三個牽拉累積總時間點均增加（P＜0.05）;而8％的牽拉應(yīng)力載荷初期(12h)可使上述基因的mRNA表達略有增加，但隨著牽拉累積時間的延長(60h)，上述基因的mRNA表達明顯降低（P＜0.05）。PPARγ、LPL、ap2基因mRNA的表達在頻率1HZ，4％的牽拉應(yīng)力載荷早期

8、(12h，24h)無明顯變化，但隨著牽拉累積時間的延長(60h)，上述基因的mRNA表達明顯降低（P＜0.05）;而8％的牽拉應(yīng)力載荷則是均導(dǎo)致PPARγ、LPL、ap2基因mRNA的表達上升(P＜0.05)。
　　(2)4％的牽拉應(yīng)力載荷時，相比較于對照組，TSCs的細胞骨架F-actin增粗，熒光增強，F(xiàn)-actin/G-actin比值增加(P＜0.05)，且在一定的增加范圍內(nèi)可以與牽伸時間呈正相關(guān)。而8％的過度牽拉應(yīng)力，牽伸

9、12h時，表現(xiàn)為細胞骨架F-actin熒光增強，F(xiàn)-actin/G-actin比值增大，但是細胞骨架F-actin的伸展性較對照組有所降低;隨著總累積牽拉時間的增加(24h、60h)，細胞骨架F-actin熒光強度逐漸變?nèi)?，細胞伸展性明顯減小，變圓，F(xiàn)-actin/G-actin比值也明顯下降(P＜0.05)。
　　(3) Cyt-D可以有效的抑制細胞骨架肌動蛋白的聚合。在TSCs成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)，以及普通完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程中，使

10、用Cyt-D抑制細胞骨架肌動蛋白聚合會促使PPARγ、LPL、ap2的mRNA表達上升(P＜0.05);而在TSCs成肌腱誘導(dǎo)牽伸，以及普通完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程中，使用Cyt-D抑制細胞骨架肌動蛋白聚合Colla1、Tnc、Scx的mRNA表達降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)不同的牽伸條件可使TSCs傾向于不同的系譜方向分化:適度的機械牽拉載荷促使TSCs傾向于成腱分化，而過度的機械牽拉載荷促使TSCs傾向于成

11、脂分化。
　　(2)不同的牽伸條件會導(dǎo)致細胞骨架出現(xiàn)不同的重塑適度的機械牽拉載荷促使TSCs細胞骨架肌動蛋白聚合增加，而過度的機械牽拉載荷則會導(dǎo)致TSCs細胞骨架F-actin斷裂、解聚。
　　(3)抑制細胞骨架肌動蛋白聚合會促進TSCs成脂分化，并導(dǎo)致適度機械牽伸對TSCs成腱分化的誘導(dǎo)效應(yīng)消失，抑制TSCs成肌腱細胞分化。
　　(4)在機械牽伸誘導(dǎo)的TSCs分化過程中，細胞骨架的變化起著非常重要的作用，它不是伴隨著