分化抑制蛋白—1（Id-1）在惡性實(shí)體腫瘤誘導(dǎo)分化中的作用.pdf

1、腫瘤細(xì)胞是分化機(jī)制失控的細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)改變、核漿比增大、細(xì)胞周期異常、過(guò)度增殖和某些生理功能的喪失等。有些惡性腫瘤細(xì)胞可以在體內(nèi)外某些因素的作用下被誘導(dǎo)而重新發(fā)生分化，惡性程度降低，這就是腫瘤的誘導(dǎo)分化治療。目前只有少數(shù)的誘導(dǎo)分化劑成功地用在血液系統(tǒng)腫瘤的治療上，而對(duì)實(shí)體瘤的誘導(dǎo)分化治療卻鮮有報(bào)導(dǎo)。另外，在腫瘤學(xué)研究中有一類(lèi)很重要的蛋白——分化抑制蛋白(Id)，它參與了胚胎細(xì)胞的分化和腫瘤的發(fā)生、侵襲、血管形成等過(guò)程，但是作為分化

2、相關(guān)的蛋白，它在腫瘤分化中所起的作用還不明確。本研究就是以分化抑制蛋白家族中表達(dá)譜最廣的Id-1作為分子靶標(biāo)，通過(guò)RNAi技術(shù)降低該蛋白的表達(dá)，來(lái)觀察該蛋白在惡性實(shí)體腫瘤誘導(dǎo)分化中的作用。 首先，本研究在體外水平上探討了Id-1蛋白在惡性腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的作用。本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)用組織芯片和免疫組化的方法證明了Id-1蛋白在肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌等多種腫瘤組織中表達(dá)，并且表達(dá)程度與腫瘤的分化程度呈負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一步明確Id-1蛋

3、白在腫瘤分化中的作用，我們采用了即可以形成實(shí)體腫瘤，又有明確分化標(biāo)志，還高表達(dá)Id-1蛋白的小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞肉瘤(DCS)細(xì)胞作為體外模型，通過(guò)RNAi的方式降低該細(xì)胞中Id-1蛋白的表達(dá)并觀察干擾后細(xì)胞的變化。我們?cè)O(shè)計(jì)并化學(xué)合成了三條針對(duì)小鼠Id-1 mRNA的小干擾RNA(siRNA)，經(jīng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染DCS細(xì)胞，Western Bloting篩選出50nM的siNM_010495_001號(hào)siRNA在轉(zhuǎn)染后12～16h對(duì)Id

4、-1蛋白的抑制效果可達(dá)90％以上，并通過(guò)Real-time PCR在mRNA水平上進(jìn)行了驗(yàn)證。 確定DCS細(xì)胞內(nèi)Id-1蛋白的表達(dá)被抑制后，我們檢測(cè)該細(xì)胞在生物學(xué)特征、分化特性和惡性行為上的改變，同時(shí)設(shè)立了空白組和無(wú)關(guān)對(duì)照組作為陰性對(duì)照，誘導(dǎo)分化劑丁酸鈉組作為陽(yáng)性對(duì)照。降低Id-1蛋白的表達(dá)后，在生物學(xué)特征上DCS細(xì)胞展現(xiàn)出趨向成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài)：細(xì)胞伸展，分枝增多、變長(zhǎng)；細(xì)胞體積增大，核漿比減??；細(xì)胞周期也發(fā)生了顯著變化，干

5、擾后24h處于G<,0>/G<,1>期的細(xì)胞由13.6％上升至26.8％，S期細(xì)胞由77.9％下降至63.9％；干擾后48hG<,0>/G<,1>期的細(xì)胞由40.2％上升至50.4％，S期細(xì)胞由37.9％下降至27.6％，P<0.01。在分化特性上，干擾DCS細(xì)胞中Id-1基因的表達(dá)后，DCS細(xì)胞出現(xiàn)了分化成熟的標(biāo)志，表現(xiàn)在樹(shù)突狀細(xì)胞的分化標(biāo)志Id-2蛋白表達(dá)增高，并且DC細(xì)胞成熟的標(biāo)志CD86由干擾前的陰性變?yōu)殛?yáng)性。我們還分別通過(guò)MT

6、T實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)證明了干擾Id-1基因表達(dá)后DCS細(xì)胞體外增殖能力、成瘤能力和侵襲能力都降低了(P<0.01)。以上結(jié)果證明降低Id-1的表達(dá)，可以誘導(dǎo)惡性實(shí)體腫瘤細(xì)胞發(fā)生分化，降低其惡性程度。此外，我們還初步探討了Id-1發(fā)揮作用的信號(hào)通路。Western Bloting結(jié)果顯示干擾Id-1基因的表達(dá)，可引起分化相關(guān)的、Id-1直接作用的下游基因E2A的表達(dá)增高，說(shuō)明降低Id-1蛋白誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的分化可能

7、是通過(guò)E2A參與的信號(hào)通路如MAPK、Notch等進(jìn)行的。 為進(jìn)一步明確降低Id-1表達(dá)在體內(nèi)水平上對(duì)腫瘤的治療作用，我們進(jìn)行了第二部分的研究。以高表達(dá)Id-1蛋白的小鼠肝癌腹水瘤(H22)為模型，將第一部分證實(shí)有效的siRNA進(jìn)行甲基化修飾，用陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹后腹腔注射治療，觀察模型小鼠在體重和腹圍上的變化來(lái)評(píng)價(jià)治療效果，同時(shí)探討RNAi體內(nèi)治療腫瘤的可行性。結(jié)果顯示，高劑量干擾組和低劑量干擾組小鼠的體重增長(zhǎng)和腹圍增長(zhǎng)都慢于無(wú)

8、關(guān)對(duì)照組，尤其是高劑量siRNA對(duì)小鼠腹水瘤的抑制作用明顯，相對(duì)抑制率在50％以上，與無(wú)關(guān)對(duì)照組相比，有明顯差異(P<0.05)。提示降低Id-1蛋白的表達(dá)可以有效抑制腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的增殖，減慢腹水的增長(zhǎng)速度，而且這種治療效果具有劑量的依賴(lài)性。 總之，通過(guò)RNAi技術(shù)降低Id-1蛋白的表達(dá)，在體外可以誘導(dǎo)實(shí)體腫瘤細(xì)胞發(fā)生分化，細(xì)胞的增殖、成瘤、侵襲能力都降低，在體內(nèi)也能有效地抑制腹水瘤細(xì)胞的增殖，減緩腹水的產(chǎn)生速度。說(shuō)明實(shí)體腫瘤