Id-1基因沉默抑制口腔鱗狀細胞癌生長轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、研究目的:
　　 1.研究分化抑制因子Id-1在口腔鱗狀細胞癌中的表達及意義,初步探討Id-1在口腔鱗狀細胞癌增殖、侵襲、血管新生以及淋巴新生的作用。
　　 2.探討慢病毒介導的RNAi對舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞中Id-1基因沉默后對細胞增殖、侵襲以及VEGF-C表達的影響。
　　 3.探討裸鼠舌癌原位移植瘤瘤內(nèi)注射Id-1-siRNA-慢病毒顆粒對移植瘤生長以及淋巴新生的影響,并對其機制進行初步探討。

2、r>　　 4.探討以Id-1基因作為靶基因抑制口腔鱗狀細胞癌生長及淋巴轉(zhuǎn)移的可行性。
　　 研究方法:
　　 1.37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)三種口腔鱗狀細胞癌細胞Tca8113舌鱗癌細胞、SAS舌癌細胞以及Bucca1885頰癌細胞,當細胞達80～90％融合時,提取三種細胞的總RNA和總蛋白。應用RT-PCR方法檢測三種細胞內(nèi)Id-1mRNA的表達,應用Western-blot方法檢測三種細胞內(nèi)Id-1蛋白的表達。將

3、培養(yǎng)的癌細胞進行細胞爬片處理,通過細胞免疫組化方法檢測Id-1蛋白在口腔鱗狀細胞癌細胞中的表達及蛋白定位。
　　 2.收集2005～2008年山東大學齊魯醫(yī)院口腔頜面外科128例口腔鱗狀細胞癌住院患者的腫瘤標本。128例患者按照年齡、性別、是否吸煙、是否飲酒、腫瘤發(fā)病部位、腫瘤大小、腫瘤臨床分期、腫瘤分化程度、腫瘤有無淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤有無復發(fā)分類。所有患者術前均未行放療、化療以及其它干預治療,并同期行頸淋巴清掃術。提取腫瘤標本的總

4、RNA和總蛋白,應用RT-PCR方法檢測腫瘤標本內(nèi)Id-1mRNA的表達,應用Western-blot方法檢測腫瘤標本內(nèi)Id-1蛋白的表達。制備腫瘤標本蠟塊,應用免疫組化方法檢測Id-1蛋白在口腔鱗狀細胞癌中的表達定位,并對免疫組化結果進行評分分析,評價Id-1蛋白的表達與臨床資料之間的關系。
　　 3.應用免疫組化方法檢測Id-1、VEGF-C蛋白在128例口腔鱗狀細胞癌標本中的表達,并以抗體CD34、LYVE-1標記腫瘤內(nèi)血

5、管和淋巴管。對Id-1、VEGF-C免疫組化結果進行評分分析,測定腫瘤微血管密度及淋巴管密度,評價Id-1蛋白的表達與血管新生、淋巴新生的關系。
　　 4.37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞,將生長狀態(tài)良好的細胞以4×104數(shù)目接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔加入2ml培養(yǎng)基。48小時后,細胞融合率可達到30～50％。將細胞分為慢病毒實驗組、慢病毒陰性對照組、ENi.S.空白對照組,分別加入Id-1-RNAi-L

6、entivirus(復感染指數(shù)MOI值為50)、NC-RFP-Lentivirus(MOI為50)和ENi.S.,37℃、5％CO2孵箱中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。
　　 RMA干擾后第五天,收集細胞,提取細胞總RNA,應用RT-PCR方法檢測不同實驗組中Id-1、VEGF-C的基因表達。RNA干擾后第六天,收集細胞,提取細胞總蛋白,應用western-blot方法檢測不同實驗組中Id-1、VEGF-C的蛋白表達。同時收集RNA干擾后第六天

7、細胞上清液,對分泌至細胞外的VEGF-C蛋白進行ELLISA檢測。分析三個不同實驗組中Tca8113細胞Id-1和VEGF-C的基因、蛋白表達情況。觀察Id-1基因沉默后對VEGF-C表達的影響。
　　 應用MTT法檢測Id-1基因沉默后1～7天Tca8113細胞的生長情況,并繪制細胞生長曲線,觀察Id-1基因沉默對Tca8113細胞增殖活性的影響。
　　 RNA干擾后第六天收集不同實驗組中Tca8113細胞,重懸于培養(yǎng)

8、液中,使終濃度為2×106/ml,吸取100ul細胞懸液加Transwell小室中。應用Transwell小室方法觀察Id-1基因沉默對Tca8113細胞侵襲性的影響。
　　 5.裸鼠舌癌腫瘤模型的建立:37℃、5％CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)Tca8113舌鱗癌細胞,在細胞生長狀態(tài)良好時配制細胞懸液,使細胞濃度達到2×106個/ml,備用。4周齡的BALB/c nu/nu雄性裸鼠,乙醚吸入麻醉后,注射0.1ml Tca8113細胞懸液

9、(細胞數(shù)量為2×105個)于裸鼠的舌側緣粘膜下。接種腫瘤細胞后,將裸鼠置于SPF飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng),每天觀察裸鼠舌部粘膜的成瘤情況。
　　 6.當裸鼠舌側緣形成的腫瘤直徑約3～5mm大小時,選擇生存狀態(tài)良好的成瘤裸鼠21只,隨機分成慢病毒干擾實驗組、慢病毒陰性對照組、ENi.S.空白對照組3個組,每組7只。分別抽取0.1ml Id-1-RNAi慢病毒顆粒溶液(MOI值為50)、RFP慢病毒顆粒溶液(MOI值為50)和ENi.S。在裸

10、鼠舌體腫瘤內(nèi)行多點注射,每周注射兩次,連續(xù)注射兩周。每天觀察腫瘤生長情況,3天測量一次腫瘤直徑,計算腫瘤體積,探討腫瘤內(nèi)注射Id-1-siRNA-慢病毒顆粒后對裸鼠移植瘤生長的影響。
　　 三周后脫頸處死三組裸鼠,收集腫瘤標本。將收集的裸鼠腫瘤部分提取RNA,檢測瘤內(nèi)注射Id-1-siRNA-慢病毒顆粒對Id-1、VEGF-C基因表達的影響。部分標本制備蠟塊,以Id-1、VEGF-C、Ki67、LYVE-1為抗體,應用免疫組化方

11、法檢測三組裸鼠腫瘤標本中Id-1、VEGF-C、Ki67的表達及淋巴管密度,研究Id-1基因沉默后對裸鼠移植瘤增殖及淋巴新生的影響。
　　 結果:
　　 1.三種口腔鱗狀細胞癌細胞中Id-1mRNA以及蛋白均存在過表達,免疫組化結果顯示Id-1蛋白既位于細胞漿也位于細胞核。
　　 2.在口腔正常粘膜組織中,Id-1表達陰性或者呈弱表達,而在口腔鱗狀細胞癌中,大部分存在過表達,128例腫瘤組織的免疫組化顯示Id-1

12、陽性表達率為64.8％。Id-1蛋白的表達與患者的性別、年齡、吸煙、飲酒、腫瘤生長部位、腫瘤分化程度均無關,而與患者腫瘤的大小、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤有無復發(fā)有關。在直徑大于31mm的腫瘤組織中Id-1蛋白的表達比小于31mm的腫瘤表達強(3.35±1.907vs4.06±2.017,p=0.013)；Ⅲ、Ⅳ期的患者腫瘤組織中Id-1蛋白的表達比Ⅰ、Ⅱ期相對強(4.19±1.875vs3.31±2.054,p=0.031)；在存在淋巴

13、轉(zhuǎn)移的患者組織標本中,Id-1蛋白的表達強度相對強(4.37±1.788vs3.26±2.048,p=0.001)；腫瘤復發(fā)的患者其表達強度亦高(4.57±2.03vs3.46±1.96,p=0.003)。
　　 3.對128例口腔鱗狀細胞癌組織中Id-1的表達情況與微血管密度、VEGF-C的表達以及癌周淋巴管密度進行Spearman相關性分析,結果發(fā)現(xiàn)Id-1的表達與微血管密度、VEGF-C的表達以及癌周淋巴管密度呈正相關(r

14、=0.223、0.569、0.240,p=0.011、0.000、0.006)。不同Id-1表達強度之間MVD的表達存在差異,在Id-1中等和強表達的標本中,其MVD明顯高于無Id-1表達和Id-1弱表達的標本(40.15±7.72 vs37.14±6.37,p=0.027)；在Id-1弱表達的組別中,VEGF-C的表達相對較低(1.87±1.30vs3.08±0.76.p=0.000),癌周淋巴管密度也相對較低(13.21±5.53v

15、s16.06±6.16,p=0.012)。
　　 4.應用慢病毒介導的Id-1-siRNA對Tca8113細胞進行Id-1基因沉默,結果發(fā)現(xiàn)在實驗后第五天RNA干擾組Id-1基因表達明顯降低,與對照組相比有顯著性差異(p<0.01)；實驗后第六天RNA干擾組Id-1蛋白表達明顯降低,與對照組相比有顯著性差異(p<0.01)。Id-1基因沉默后Tca8113細胞的VEGF-C基因表達明顯降低(p<0.01)；Western-blo

16、t和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)VEGF-c的蛋白表達也明顯降低(p<0.01)。
　　 應用MTT法檢測Id-1基因沉默后Tca8113細胞增殖活性,結果發(fā)現(xiàn)在干擾實驗后的前三天,三組Tca8113細胞的增殖活性未見明顯差異,第四天開始,干擾組細胞的增殖活性與兩對照組相比出現(xiàn)降低,統(tǒng)計學上有顯著性差異(4、5、6、7天p=0.036,0.004,0.001,0.002)。
　　 應用Transwell小室方法觀察Id-1基因沉默