豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的培養(yǎng)、鑒定及豬MEF2B和MEF2C基因的初步研究.pdf

1、骨骼肌衛(wèi)星細胞是骨骼肌中位于肌細胞膜和基膜之間的具有增殖分化潛力的肌源性細胞。它們在一般情況下是處于靜息狀態(tài)的，當被激活后，具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌細胞的能力。由于骨骼肌衛(wèi)星細胞在骨骼肌生長發(fā)育以及再生中扮演著非常重要的地位，很多科學家已經(jīng)開始研究它的生理特性，目前國內(nèi)外豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的研究工作開展的還比較少；而肌細胞增強因子2（MEF2）屬于MADS框轉錄因子家族，它們在肌肉發(fā)生過程中起著非常重要的調節(jié)作用，目前關于豬ME

2、F2因子的研究還未見報道。 本研究中，建立并完善了豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的培養(yǎng)方法。采用I型膠原酶和胰蛋白酶兩步消化法獲取新生豬骨骼肌衛(wèi)星細胞，并進行體外原代和傳代培養(yǎng)。觀察細胞各個階段的形態(tài)，通過生長曲線等手段研究骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖與分化能力，利用RT-PCR以及免疫細胞化學染色對所獲得的細胞進行鑒定。結果顯示兩步消化法適用于骨骼肌衛(wèi)星細胞的獲取。在生長培養(yǎng)基作用下，細胞增殖旺盛；在分化培養(yǎng)基下，細胞分化良好，可融合成肌管。

3、 通過比較基因組學的方法克隆了豬MEF2基因家族中的MEF2B和MEF2C基因以及豬CACNGI基因。獲得了包括完整編碼區(qū)的長度為1940bp的MEF2C基因和長度為1136bp的CACNGI基因的cDNA序列；通過RACE得到了豬MEF2B基因的5′非翻譯區(qū)序列，將該序列與PCR擴增的產(chǎn)物拼接后得到了長度大約為1070bp的豬MEF2B基因cDNA序列。將豬MEF2C、MEF2B和CACNG1基因的序列提交到NCBI中GenBank

4、中，登錄號分別為DQ343149、DQ366898和DQ323981。 分析豬MEF2C和MEF2B基因的編碼區(qū)序列發(fā)現(xiàn)，兩個基因都含有MADS保守結構域，進一步將豬的MADS保守結構域和人及小鼠的結構域比對發(fā)現(xiàn)此順式作用元件非常保守，表明MEF2因子在這3個物種肌肉發(fā)生過程中扮演同樣重要的作用。比較豬MEF2C基因和人MEF2C基因的編碼區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)它們間的相似性為91％，同時發(fā)現(xiàn)豬MEF2C基因序列缺少了與人第8外顯子以及第

5、11外顯子的部分序列相對應的序列，由于在人、鼠研究上證明MEF2家族存在多種剪接體，因此預測豬MEF2C基因也存在不同的剪接體。 RT-PCR分析了豬MEF2B和MEF2C基因在組織以及骨骼肌細胞體外分化過程中的表達情況。組織表達譜分析結果表明，兩個基因除了在胃、小腸、胚胎等組織無法檢測到外，其他組織都有大量的表達；而在骨骼肌細胞體外分化過程中的表達模式研究發(fā)現(xiàn)，隨著分化的深入，兩個基因的表達量越來越大；而在骨骼肌衛(wèi)星細胞時期兩

6、個基因的表達量很少，這與組織表達譜分析中胚胎幾乎無法檢測到兩個基因表達的結果是一致的。 獲得了大白、梅山、長白等三個品種的豬MEF2B基因的第2、8內(nèi)含子以及豬MEF2C基因的第7、8內(nèi)含子序列。通過序列比較，發(fā)現(xiàn)在豬MEF2B基因的第2內(nèi)含了147bp處出現(xiàn)堿基T－C轉換（梅山豬中為T，大白豬中為C），可引起限制性內(nèi)酶Eco721酶切多態(tài)性，在大白×梅山F2代資源家系中進行PCR-RFLP基因分析，結果發(fā)現(xiàn)存大白×梅山F2代資

7、源家系中存在著嚴重的偏態(tài)：而在豬MEF2B基因的第8內(nèi)含子中，發(fā)現(xiàn)一個新的微衛(wèi)星重復序列（AG重復序列），重復測序結果表明在梅山中為（AG）<,12>，大白為（AG）<,27>，長白為（AG）<,29>，在大白×梅山F2代資源家系中進行PCR－SSR分析，結果表明該微衛(wèi)星位點與皮厚、背膘厚、胴體長、眼肌高以及眼肌寬等性狀顯著相關。 目前在國內(nèi)鮮有以豬的骨骼肌衛(wèi)星細胞為模型研究基因功能的報道，本研究首先探討了豬骨骼肌衛(wèi)星細胞體外培