MiR-486調(diào)控造血系統(tǒng)低氧反應(yīng)的作用與機(jī)制.pdf

1、低氧可以影響細(xì)胞生長因子的分泌及分化等生物學(xué)特性。造血系統(tǒng)是人類對(duì)低氧環(huán)境適應(yīng)的最敏感的組織之一，也是研究細(xì)胞低氧反應(yīng)的理想模型。微小 RNA（microRNA，miRNAs）可以通過調(diào)控功能基因的表達(dá)而在細(xì)胞的低氧反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。其中，微小 RNA-486（microRNA-486，miR-486）是首先從人的胎肝組織中鑒定發(fā)現(xiàn)的miRNAs，其被證實(shí)與造血細(xì)胞紅系分化密切相關(guān)。而眾所周知低氧環(huán)境可以促進(jìn)骨髓紅細(xì)胞的生成過程，因此

2、，我們推測miR-486可能參與了低氧環(huán)境下骨髓造血的過程。人類對(duì)于低氧環(huán)境的適應(yīng)包括造血干細(xì)胞的適應(yīng)以及造血微環(huán)境的適應(yīng)。目前，miR-486在骨髓低氧適應(yīng)中的作用尚不明確，本研究論文以造血微環(huán)境中的重要細(xì)胞—骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)及造血細(xì)胞系TF-1細(xì)胞作為研究對(duì)象，旨在研究miR-486在骨髓低氧適應(yīng)中的作用及機(jī)制。本研究分為兩個(gè)部分：
　　

3、第一部分：MiR-486調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞低氧反應(yīng)的作用及機(jī)制。
　　目的：探索miR-486在調(diào)控骨髓造血微環(huán)境的重要細(xì)胞BM-MSCs低氧反應(yīng)中的作用，并研究其對(duì) BM-MSCs血管生成因子分泌及細(xì)胞存活中的作用及機(jī)制。
　　方法：⑴用Ficoll法分離健康成年人骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞，通過貼壁生長獲得BM-MSCs；⑵用qRT-PCR檢測不同培養(yǎng)條件下BM-MSCsmiR-486的表達(dá)；⑶用qRT-PCR和ELISA檢測

4、不同培養(yǎng)條件下BM-MSCs細(xì)胞因子的表達(dá)與分泌；⑷用慢病毒感染技術(shù)將 BM-MSCs miR-486過表達(dá)或沉默；⑸細(xì)胞的生物學(xué)特性，包括增殖、凋亡及遷移，均應(yīng)用了商業(yè)試劑按照說明書檢測；
　　結(jié)果：研究顯示我們成功分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增了BM-MSCs；低氧可以促進(jìn) BM-MSCs miR-486的表達(dá)；與感染對(duì)照病毒的BM-MSCs相比，過表達(dá) miR-486可以促進(jìn) BM-MSCs細(xì)胞因子的分泌及細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡；而沉默

5、miR-486可以抑制 BM-MSCs細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；MiR-486通過調(diào)控 PTEN-PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié) BM-MSCs的生物學(xué)特性。
　　結(jié)論：MiR-486是一種新發(fā)現(xiàn)的低氧相關(guān)miRNAs，可以通過PTEN-PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)BM-MSCs的生物學(xué)特性。
　　第二部分：MiR-486調(diào)控造血細(xì)胞增殖、分化及糖代謝的作用及機(jī)制。
　　目的：探討miR-486在紅系白血病細(xì)胞 TF-

6、1細(xì)胞低氧反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用，及其對(duì) TF-1細(xì)胞增殖、分化及糖代謝等生物學(xué)特性的影響。
　　方法：⑴將TF-1細(xì)胞進(jìn)行低氧處理，用qRT-PCR檢測 miR-486、pri-miR486、HIF-1α、HIF-2α、Sirt1的表達(dá)，用流式細(xì)胞儀檢測了TF-1細(xì)胞CD235a的表達(dá)；⑵用慢病毒感染技術(shù)將 TF-1過表達(dá)miR-486，用qRT-PCR及Westernblot檢測Sirt1的表達(dá)，用qRT-PCR檢測 Glut1、G

7、lut4等糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，用Dye670染色法及 CCK8法檢測 TF-1的增殖；⑶用慢病毒感染技術(shù)將TF-1沉默 miR-486，用qRT-PCR及 Western Blot檢測 Sirt1的表達(dá)，用qRT-PCR檢測了Glut1、Glut4等糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，用Dye670染色法及 CCK8法檢測 TF-1的增殖,用流式細(xì)胞儀檢測 TF-1細(xì)胞CD235a的表達(dá)及紅系分化；⑷用慢病毒感染技術(shù)將 TF-1細(xì)胞沉默Sirt1后

8、用qRT-PCR及WesternBlot檢測Sirt1的表達(dá)，用qRT-PCR檢測了Glut1、Glut4等糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，用Dye670染色法及CCK8法檢測TF-1的增殖；用流式細(xì)胞儀檢測TF-1細(xì)胞 CD235a的表達(dá)及紅系分化。
　　結(jié)果：低氧可以促進(jìn)TF-1細(xì)胞miR-486、pri- miR486、HIF-1α、HIF-2α的表達(dá)，抑制 Sirt1的表達(dá)；低氧可以促進(jìn) TF-1細(xì)胞的紅系分化能力；與感染對(duì)照病毒的

9、TF-1細(xì)胞相比，miR-486過表達(dá)抑制TF-1細(xì)胞Sirt1的表達(dá)，促進(jìn) Glut1、Glut4的表達(dá)，并可以促進(jìn) TF-1增殖；與感染對(duì)照病毒的TF-1細(xì)胞相比，miR-486沉默后促進(jìn)TF-1細(xì)胞 Sirt1的表達(dá)，抑制Glut1和Glut4的表達(dá)，抑制 TF-1增殖，抑制 TF-1紅系分化；與感染對(duì)照病毒的TF-1細(xì)胞相比，Sirt1沉默促進(jìn) Glut1和 Glut4的表達(dá)，促進(jìn) TF-1紅系分化。
　　結(jié)論：miR-4