正反交豬骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)及表觀遺傳修飾的發(fā)育性變化研究.pdf

1、本論文選取大約克和二花臉正交(大約克公豬×二花臉母豬，YE)和反交(二花臉公豬×大約克母豬，EY)豬，分別在妊娠的第50天(E50)、70天(E70)、90天(E90)和出生后的第1天(D1)，20天(D20)、70天(D70)、120天(D120)、180天(D180)采集背最長(zhǎng)肌和半腱肌進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)一，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)了胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)系統(tǒng)主要基因IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGF-ⅠR、IGF-ⅡR和IGF

2、BP-3在正反交豬中的發(fā)育性表達(dá)模式，比較了正反交之間的差異，分析了基因表達(dá)水平與出生后肌纖維橫切面積的相關(guān)性。試驗(yàn)二，在檢測(cè)生肌調(diào)節(jié)因子家族的MyoD、MyoG以及肌肉生長(zhǎng)抑制素基因MSTN發(fā)育性表達(dá)模式的基礎(chǔ)上，采用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)結(jié)合定量PCR技術(shù)分析了MyoD、MyoG和MSTN基因啟動(dòng)子區(qū)H3乙?；3K4 me3修飾的發(fā)育性變化，同時(shí)采用Sequenom MassARRAY系統(tǒng)測(cè)定了MyoD和MyoG基因啟動(dòng)子區(qū)

3、DNA甲基化修飾的發(fā)育性變化，最后分析了這些表現(xiàn)遺傳修飾對(duì)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育重要調(diào)控基因表達(dá)的影響。
　　 1.大約克和二花臉正反交F1代出生前后骨骼肌中胰島素樣生長(zhǎng)因子系統(tǒng)重要基因的表達(dá)
　　 本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法分析了正反交豬背最長(zhǎng)肌和半腱肌中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGF-ⅠR、IGF-ⅡR和IGFBP-3的發(fā)育性表達(dá)，結(jié)果表明：(1)骨骼肌組織中IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ mRNA的表達(dá)隨著發(fā)育階段而變化(P

4、<0.05)。出生后，正反交豬IGF-Ⅰ mRNA的表達(dá)呈波動(dòng)上升的趨勢(shì)，相反，IGF-Ⅱ mRNA的表達(dá)呈波動(dòng)下降的趨勢(shì)。除了反交豬120日齡的半腱肌以外，IGF-ⅠR mRNA的表達(dá)水平在出生前顯著高于出生后(P<0.05)。IGF-ⅡR mRNA的表達(dá)隨著發(fā)育階段和正反交的不同而顯著變化(P<0.05)。IGFBP-3 mRNA的表達(dá)水平隨著發(fā)育階段和正反交的不同而變化(P<0.05)，但是半腱肌在出生后沒(méi)有差異。(2)IGF-Ⅱ

5、(E50-D180)，IGF-ⅠR(E50-D180)，IGF-ⅡR(E50-D1，背最長(zhǎng)?。籈70-D20，半腱肌)以及IGFBP-3(E70-D70，背最長(zhǎng)??；E50-D180，半腱肌)與IGF-Ⅰ呈顯著的正相關(guān)。IGF-ⅠR(E50-D180)，IGF-ⅡR(E50-D20，背最長(zhǎng)?。籈70-D20，半腱肌)以及IGFBP-3(E50-D180)與IGF-Ⅱ呈正相關(guān)。IGF-ⅡR(E50-D20，背最長(zhǎng)??；E50-D1，半腱肌)以

6、及IGFBP-3(E50-D180)與IGF-ⅠR呈正相關(guān)，IGF-ⅡR(E70-D70)與IGFBP-3正相關(guān)。(3)在D20-D180，肌纖維的橫切面積(CAS)的變化與IGF-Ⅰ，IGF-ⅠR和IGF-ⅡR有相似的趨勢(shì)，而與IGF-Ⅱ和IGFBP-3正好相反。這些結(jié)果表明正反交豬骨骼肌中IGF系統(tǒng)基因的表達(dá)顯示特異的發(fā)育性模式，這些基因在特定時(shí)期的表達(dá)是相關(guān)的。
　　 2.大約克和二花臉正反交F1代出生前后骨骼肌MyoD、

7、MyoG和MSTN基因的表達(dá)
　　 本研究發(fā)現(xiàn)：不同的雜交方式和發(fā)育階段顯著影響MyoD mRNA的表達(dá)水平(P<0.05)。MyoG mRNA的表達(dá)水平出生前顯著高于出生后，但是反交豬半腱肌和正交豬背最長(zhǎng)肌的MyoG在180日齡有一個(gè)顯著升高(P<0.05)，且正反交間差異顯著。MSTNmRNA的表達(dá)水平出生前顯著高于出生后，且正反交間差異顯著.比較發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因在胚胎期是反交豬高于正交豬，而出生后呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。結(jié)果還表明M

8、STN與MyoG(50E-D180)在背最長(zhǎng)肌和半腱肌中正相關(guān)，而與MyoD在背最長(zhǎng)肌申有相似的趨勢(shì)。
　　 3.染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)分析正反交豬背最長(zhǎng)肌中MyoD、MyoG和MSTN基因啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白修飾
　　 H3ac和H3K4me3與激活基因表達(dá)有關(guān)。本試驗(yàn)利用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)結(jié)合定量PCR技術(shù)分析MyoD、MyoG和MSTN基因啟動(dòng)子區(qū)H3K4me3、H3乙?；揎椀陌l(fā)育性變化，并且比較了正反交

9、之間的差異。結(jié)果表明：(1)正交豬MyoD和MyoG基因啟動(dòng)子區(qū)H3ac除了90胎齡和1日齡外，其它發(fā)育階段有相似的模式，呈波動(dòng)性變化。反交豬MyoD和MyoG的H3ac模式完全相同，在120日齡顯著較高，其它階段基本不變。MSTN基因啟動(dòng)子區(qū)不同區(qū)段H3ac也不完全相同，我們發(fā)現(xiàn)相鄰的MSTN107和MSTN279的H3ac的發(fā)育性變化模式相似，正交豬前三個(gè)區(qū)段H3ac波動(dòng)變化較大，而反交豬除了MSTN163的H3ac波動(dòng)變化較大外，

10、其余四個(gè)區(qū)段的H3ac變化很小。(2)正交豬MyoD和MyoG基因啟動(dòng)子區(qū)H3K4me3呈相似的波動(dòng)性變化，反交豬MyoD基因的H3K4me3修飾在50胎齡到180日齡間均無(wú)顯著性變化，MyoG基因H3K4me3在1日齡、70日齡、120日齡和180日齡顯著高于胚胎期和20日齡。對(duì)于MSTN基因，除了MSTN278的H3K4me3在180日齡出現(xiàn)顯著升高以外，正反交豬MSTN基因啟動(dòng)子區(qū)四個(gè)區(qū)段H3K4me3的發(fā)育性變化模式相似，但正反

11、交之間在特定的發(fā)育階段存在差異?？傊琈yoD、MyoG和MSTN基因啟動(dòng)子區(qū)H3ac和H3K4me3絕大多數(shù)發(fā)育階段都是正交高于反交，但是，在胚胎期這些基因的表達(dá)都是正交低于反交，組蛋白修飾模式與基因表達(dá)圖譜相反。但是在出生后的基因表達(dá)基本上是正交豬高于反交豬的，組蛋白修飾模式與基因表達(dá)圖譜基本相似。
　　 4.正反交豬背最長(zhǎng)肌中MyoD和MyoG基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化
　　 采用Sequenom MassARRA

12、Y系統(tǒng)分析MyoD和MyoG基因基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化，結(jié)果表明：MyoD基因啟動(dòng)子區(qū)包括8個(gè)CpG位點(diǎn)，共分成4個(gè)CpG單位，第4個(gè)CpG位點(diǎn)沒(méi)有檢測(cè)到甲基化。研究發(fā)現(xiàn)不同位點(diǎn)DNA甲基化程度不同，Site1，2，3的甲基化水平較高，而site5，6和site7，8呈現(xiàn)較低的甲基化水平。Site1，2，3的甲基化正反交間比較沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差異，而site5，6和site7，8的甲基化正反交豬群在特定的發(fā)育階段存在差異(P<0.05)。所有

13、CpG位點(diǎn)的總體甲基化，正交豬除了50和70胎齡顯著高于120和180日齡外(P<0.05)，其它階段沒(méi)有差異，反交豬在不同發(fā)育階段的總體甲基化水平?jīng)]有明顯差異，正反交問(wèn)比較也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差異。本試驗(yàn)擴(kuò)增了MyoG基因啟子523bp的片段，包括8個(gè)CpG位點(diǎn)，第1和第6個(gè)CpG位點(diǎn)沒(méi)有檢測(cè)到甲基化。MyoG基因啟子區(qū)DNA甲基化波動(dòng)變化較大，正反交呈現(xiàn)不同的模式，反交豬在70胎齡(P<0.05)、20(P<0.05)、70(P<0.01)、