豬肌肉組織骨骼肌特異性基因a-actin啟動子的克隆及功能驗證.pdf

1、外源基因如何高效的在受體組織中表達是基因工程研究的關(guān)鍵。而外源基因的表達首先取決于其轉(zhuǎn)錄的啟動。高等動物基因的表達具有時間和空間性。組織特異性啟動子又稱為器官特異性啟動子。在這類啟動子的作用下,基因的表達往往只限于某些特定的組織或器官,同時表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)等特性。但是到目前為止,分離和獲得利用的組織特異性啟動子少之又少,并且伴隨著活性低組織特異性并不是很高的缺點。國外已分離利用的組織特異性啟動子都有專利保護,這極大了限制了我國在轉(zhuǎn)基因動物

2、制藥、畜禽的品種改良及各種疾病的靶向基因治療等方面的應(yīng)用。本論文選擇了豬的骨骼肌特異性表達基因α-actin的啟動子作為研究的對象,通過對其克隆、分離及功能驗證獲得調(diào)控能力相對較強的同時又保持肌肉組織特異性的啟動子區(qū)域,并通過構(gòu)建雙啟動子的策略力圖改善啟動子的活性并保證其組織特異性。為未來篩選可以高效利用的啟動子打下基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用比較基因組學的方法,將豬的骨骼肌特異性表達基因α-actin的DNA序列輸

3、入NCBI的BLASTn數(shù)據(jù)庫,搜索獲得此基因的上游調(diào)控序列。
　　 2.選擇豬的α-actin基因包含部分第一內(nèi)含子的上游調(diào)控序列2006bp,提交TESS、TFSEARCH及MethPrimer等生物信息學軟件對其核心啟動子區(qū)域、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、不同轉(zhuǎn)錄元件及CpG島分布情況進行預(yù)測預(yù)測和分析。發(fā)現(xiàn)此段序列存在啟動子區(qū)的典型特征結(jié)構(gòu)TATA box,含有肌肉組織特異性的諸多轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合元件,如MyoD、MEF2及MyoG

4、等。
　　 3.根據(jù)生物信息學軟件在線預(yù)測的結(jié)果,設(shè)計缺失引物,以已經(jīng)擴增獲得的2006bp的pMD18-T重組載體為模板,PCR擴增獲得6個5’側(cè)翼缺失片段和2個3’側(cè)翼缺失片段。首先將這些片段插入到pMD18-T載體中,抽提質(zhì)粒,酶切回收目的片段,再將這些片段插入到pGL3-basic載體中的報告基因螢火蟲熒光素酶的上游多克隆位點處,構(gòu)建相應(yīng)的報告基因表達載體。將這些載體分別轉(zhuǎn)染C2C12、PK.及分化的C2C12細胞,通過

5、雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析報告基因螢火蟲熒光素酶的相對活性,從而獲得不同的缺失片段在相同的細胞中及相同的缺失片段在不同的細胞中啟動活性的強弱。結(jié)果表明這幾個缺失片段在分化的C2C12中表達活性最高,其次是C2C12細胞,表達活性最低的是PK細胞。最終獲得了相對表達活性最高并同時保持肌肉組織特異性的268bp的核心區(qū)段。
　　 4.分別設(shè)計引物,以pIRES2-AcGFP1為模板,PCR擴增獲得啟動子CMV560bp、SV40231b

6、p的核心區(qū)段。
　　 5.通過添加酶切位點的方式,分別將啟動子CMV、SV40及初步篩選到的豬的骨骼肌特異性表達基因α-actin啟動子區(qū)的具備肌肉組織特異性且表達活性相對較高的區(qū)段插入到pGL3-basic載體中的報告基因螢火蟲熒光素酶的上游多克隆位點處,構(gòu)建四種分別包含組成型啟動子CMV或者是SV40及豬的骨骼肌特異性表達基因α-actin啟動子的雙啟動子的報告基因表達載體。分別將這四種不同的表達載體利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時轉(zhuǎn)染

7、C2C12、PK及分化的C2C12細胞。通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)CMV或者是SV40可顯著改善豬的骨骼肌特異性表達基因α-actin啟動子的活性,其中啟動子CMV的效果尤其明顯。(2)包含不同組合的雙啟動子的表達載體在分化的C2C12細胞中表達活性最高,依次為C2C12、PK。
　　 6.以質(zhì)粒pDsRed-N1為模板,擴增獲得攜帶酶切位點BglⅡ和HindⅢ的RFP片段,連至重組載體pGL3-