腫瘤特異性啟動子調(diào)控SEA基因抗肺癌的實驗研究.pdf

1、目的： 本研究首先以紅色熒光蛋白為目的基因，比較肝癌來源的hTERT啟動子、肺癌來源的hTERT啟動子以及Survivin啟動子腫瘤特異性啟動子在肺癌A549中的啟動活性；選擇在A549肺癌細胞中有較強啟動活性的Survivin啟動子為調(diào)控序列，構(gòu)建pGL-S-SEA真核表達質(zhì)粒；通過RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒在A549細胞中的特異性表達；通過PBMC刺激實驗以MTT法檢測重組質(zhì)粒在A549細胞中的表達產(chǎn)物的超抗原活性；表達產(chǎn)物活

2、化的PBMC的抗A549細胞活性的研究。本研究旨在為探索肺癌及其它腫瘤的靶向基因治療途徑及機理奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.用PCR法和基因克隆技術(shù)在真核表達質(zhì)粒pGL3-hTERT、基礎(chǔ)上分別構(gòu)建3種啟動子調(diào)控的、以紅色熒光蛋白為目的基因的真核表達質(zhì)粒pGL-H-RED、pGL-LH-RED和pGL-S-RED。 2.將該3種重組質(zhì)粒分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人肺腺癌細胞(A549)和人胚肺成纖維細胞(MRC-5)，72h后在

3、熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白的表達，并用Imagepro-Plus6.0分析3種啟動子在相同時間內(nèi)啟動紅色熒光蛋白的表達水平。 3.以ATCC25923金黃色葡萄球菌基因組為模板，PCR擴增sea基因。選擇在A549肺癌細胞中有較強啟動活性的Survivin啟動子為調(diào)控序列，以pGL-S-RED為基礎(chǔ)，由sea基因替代其“Red”基因，構(gòu)建pGL-S-SEA真核表達質(zhì)粒；用脂質(zhì)體將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞，72h后提取總RNA，通

4、過RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒在A549細胞中的特異性表達。 4.用脂質(zhì)體將pGL-S-SEA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞,72h后，收集細胞培養(yǎng)的上清液和轉(zhuǎn)染細胞裂解液。制備健康獻血者PBMC，用上清液和細胞裂解液進行PBMC刺激實驗，并用MTT法、通過比較刺激指數(shù)以檢測其促細胞增殖效應(yīng)。 5.制備經(jīng)細胞裂解液、上清液誘導(dǎo)24h后的PBMC，分別將其與A549細胞共同培養(yǎng)，24h后，用MTT法、通過比較其殺傷率以檢測測其殺瘤效應(yīng)。

5、 結(jié)果： 1.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切及DNA測序證實pGL-H-RED、pGL-LH-RED和pGL-S-RED真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功；重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化A549細胞和MRC-5細胞72h后，在A549細胞中觀察到了紅色熒光蛋白的表達，而在MRC-5細胞中無紅色熒光表達。經(jīng)Imagepro-Plus6.0分析，pGL-S-RED熒光蛋白在A549細胞中表達最強，pGL-LH-RED次之，pGL-H-RED最弱，在A549細胞中的

6、熒光強度(IOD)分別為201.17、171.70和136.34。 2.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切及DNA測序證實pGL-S-SEA真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化A549細胞后，RT-PCR.結(jié)果表明，pGL-S-SEA質(zhì)粒在A549細胞中成功表達sea目的基因，基強度為內(nèi)參(GADPH gene)的65.96％。 3.經(jīng)MTT實驗結(jié)果證實，pGL-S-SEA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化A549細胞的裂解液具有促進人PBMC增殖活性、上清液無明顯促

7、PBMC增殖作用，裂解液實驗組、上清液實驗組和PHA陽性對照組的刺激指數(shù)分別為1.29、0.95和1.58。 4.經(jīng)MTT實驗結(jié)果證實，經(jīng)pGL-S-SEA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化A549細胞裂解液誘導(dǎo)的PBMC，表現(xiàn)出一定的殺傷A549細胞的活性，其中裂解液實驗組和對照組的殺傷活性分別為31.965％和21.116％。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了3種腫瘤特異性啟動子調(diào)控的、以紅色熒光蛋白為目的基因的真核表達質(zhì)粒，3種啟動子均表現(xiàn)出