由腫瘤特異性啟動(dòng)子mTERT promotor驅(qū)動(dòng)的m4-1BBL基因治療小鼠肝細(xì)胞肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建由mTERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)m4-1BBL，基因的重組腺病毒載體，對(duì)比由非特異性啟動(dòng)子-CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)m4-1BBL基因的腺病毒載體，從體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討其治療小鼠肝細(xì)胞肝癌的效果。
　　 方法：分別用PCR方法和RT-PCR方法從C57BL/6小鼠的組織中克隆其mTERT啟動(dòng)子基因和m4-1BBL基因，測(cè)序證實(shí)；按試劑盒操作分步將克隆成功的兩個(gè)基因亞克隆到pAD/PL-DESI、GatewayVector載體系統(tǒng)上，構(gòu)建重組

2、腺病毒載體質(zhì)粒pAD-mTERT-promotor-m4-1BBL，同樣方法克隆對(duì)照組pAD-CMV-m4-1BBL和空載體病毒質(zhì)粒pAD，PacI將三種質(zhì)粒線性化后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293A包裝細(xì)胞，包裝和擴(kuò)增病毒：rAD、rAD-CMV-m4-1BBL和rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL，細(xì)胞免疫化學(xué)方法證實(shí)病毒擴(kuò)增成功。分別用上述三種病毒轉(zhuǎn)染小鼠肝癌細(xì)胞株Hepal-6和小鼠成纖維細(xì)胞株L929，用m4-1BBL的流式

3、直標(biāo)單克隆抗體檢測(cè)添加不同滴度的病毒后m4-1BBL，分子在兩種細(xì)胞表面的表達(dá)；以MOI=10的濃度分別添加病毒到Hepal-6和L929細(xì)胞中，MTT檢測(cè)單純添加病毒對(duì)兩種細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響，AnnexinV和PI檢測(cè)添加病毒后細(xì)胞的凋亡情況，判斷單純添加病毒對(duì)兩種細(xì)胞的影響；提取同源小鼠脾淋巴細(xì)胞，用小鼠T淋巴細(xì)胞陰性選擇免疫磁珠純化脾淋巴細(xì)胞為T淋巴細(xì)胞，用植物血凝素(PHA)和小鼠功能性CD3和CD28抗體分別活化脾T淋巴細(xì)胞，

4、將活化好的T淋巴細(xì)胞加入已經(jīng)添加各種病毒的兩種細(xì)胞中進(jìn)行淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，MTT檢測(cè)病毒對(duì)兩種細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，AnnexinV和PI檢測(cè)添加病毒和活化T淋巴細(xì)胞后靶細(xì)胞的凋亡情況；將Hepal-6以不同的數(shù)量接種到同源小鼠的皮下，觀察小鼠皮下種植瘤的成瘤情況；以3×106數(shù)量建立小鼠肝癌皮下種植瘤模型，給已經(jīng)建立種植瘤的小鼠瘤內(nèi)多點(diǎn)注射三種不同的重組腺病毒載體，觀察腺病毒載體對(duì)腫瘤的治療作用，抽取小鼠的血液檢測(cè)肝功能情況，摘取腫瘤或腫瘤

5、部位及相應(yīng)個(gè)體小鼠的肝臟進(jìn)行病理學(xué)檢查；將三種重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染Hepal-6細(xì)胞，以3×106數(shù)量將不同的轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞及野生株腫瘤細(xì)胞接種到同源小鼠皮下，研究轉(zhuǎn)基因的腫瘤細(xì)胞的成瘤情況，摘取腫瘤進(jìn)行病理學(xué)檢查，觀察淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)PCR檢測(cè)和直接測(cè)序證實(shí)克隆的mTERT啟動(dòng)子基因和m4-1BBL基因與GeneBank上的序列完全一致，證實(shí)目的基因克隆正確；
　　 2.PCR證實(shí)

6、亞克隆的重組腺病毒質(zhì)粒中含有(或排除含有)相應(yīng)的基因；
　　 3.細(xì)胞免疫化學(xué)方法證實(shí)病毒在293A細(xì)胞中擴(kuò)增成功并測(cè)定其滴度達(dá)到1×1010pfu/ml；
　　 4.將上述三種病毒以不同的滴度轉(zhuǎn)染小鼠肝癌細(xì)胞株Hepal-6和小鼠成纖維細(xì)胞株L929，發(fā)現(xiàn)添加了rAD的兩種細(xì)胞中均不能檢測(cè)到m4-1BBL分子的表達(dá)，在添加了rAD-CMV-m4-1BBL的兩種細(xì)胞中都檢測(cè)到了高表達(dá)的m4-1BBL分子，添加了rAD-m

7、TERT-promotor-m4-1BBL的Hepal-6細(xì)胞上檢測(cè)到了較高表達(dá)的m4-1BBL分子，而在L929細(xì)胞上沒有檢測(cè)到有明顯意義的m4-1BBL分子表達(dá)；
　　 5.對(duì)比三組在不同時(shí)間和不同添加滴度m4-1BBL的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，MOI=10的滴度對(duì)靶細(xì)胞的影響較小，添加病毒后48小時(shí)m4-1BBL分子的表達(dá)較高；
　　 6.將三種病毒以MOI=10的滴度添加給兩種細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)三種病毒對(duì)兩種細(xì)胞均有一定的抑制作用，以

8、rAD-CMV-m4-1BBL最為明顯，其抑制作用與其它兩種病毒的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，對(duì)兩種細(xì)胞的抑制作用在rAD和rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL兩種病毒之間沒有差異(P＞0.05)，在上述滴度和時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)添加病毒后兩種細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)添加rAD-CMV-m4-1BBL對(duì)兩種細(xì)胞都有較強(qiáng)大的促凋亡作用，而添加rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL僅在小鼠肝癌細(xì)胞株Hepal-6有

9、較強(qiáng)的促凋亡作用，對(duì)非腫瘤細(xì)胞L929則無；添加rAD對(duì)兩種細(xì)胞均無促凋亡作用；
　　 7.用CD3直標(biāo)流式抗體檢測(cè)磁珠純化后的小鼠脾T淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其CD3的表達(dá)率達(dá)到95％以上；分別用植物血凝素(PHA)和功能性CD3CD28順序活化純化后的T淋巴細(xì)胞，在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞均出現(xiàn)聚團(tuán)現(xiàn)象，流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過功能性抗體活化后的CD69和CD25在48小時(shí)的表達(dá)率均達(dá)到50％左右；
　　 8.將活化后48小時(shí)的T淋巴細(xì)胞與已

10、經(jīng)添加三種病毒48小時(shí)的兩種細(xì)胞進(jìn)行淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，MTT觀察兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)：無論是單純添加活化T細(xì)胞還是添加任何一種病毒的兩種細(xì)胞，均與正常對(duì)照組的細(xì)胞的生長(zhǎng)之間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；單純添加活化T細(xì)胞組與添加任何一種病毒的兩種細(xì)胞生長(zhǎng)之間同樣存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；與活化T細(xì)胞混合培養(yǎng)的添加rAD-CMV-m4-1BBL的兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制明顯強(qiáng)于混合培養(yǎng)的添加rAD或rAD-mTERT-pr

11、omotor-m4-1BBL病毒(P＜0.05)；rAD和rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL兩組之間差異不明顯(P＞0.05)；將上述5組細(xì)胞分別在12、24、48和72小時(shí)檢測(cè)靶細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)加入了活化T淋巴細(xì)胞與添加了病毒的兩種細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)后，各組細(xì)胞的凋亡情況均加重了，尤其是rAD-CMV-m4-1BBL組；添加rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL與活化T淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)的Hepal

12、-6細(xì)胞凋亡明顯，而添加rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL與活化T淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)的L929細(xì)胞凋亡則不明顯，其它組別的兩種細(xì)胞凋亡情況均不明顯；
　　 9.給C57BL/6小鼠皮下注射不同數(shù)量的Hepal-6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)3×106和4×106組成瘤情況較好，與其它組別(1×106和2×106)比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，但3×106和4×106兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　 10.以3×1

13、06個(gè)Hepal-6細(xì)胞皮下注射建立C57BL/6小鼠皮下肝癌移植瘤模型，將三種重組腺病毒載體瘤內(nèi)注射發(fā)現(xiàn)：注射rAD-CMV-m4-1BBL重組腺病毒載體小鼠的皮下腫瘤基本上消失了，而注射rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL的小鼠腫瘤明顯縮小，注射rAD小鼠腫瘤大小變化不大，注射PBS的小鼠腫瘤進(jìn)行性增大，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠無明顯死亡現(xiàn)象，肝功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，注射rAD-CMV-m4-1BBL的個(gè)體谷丙及谷草轉(zhuǎn)氨酶的水平

14、高于其它各組，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，其余各組間差異不明顯(P＞0.05)，組織切片顯示：注射rAD-CMV-m4-1BBL的小鼠腫瘤部位未見到正常腫瘤細(xì)胞，僅遺留腫瘤細(xì)胞的殘骸(細(xì)胞輪廓)，有淋巴結(jié)增生，注射rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL的小鼠腫瘤部位可見小片帶狀癌巢，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，壞死灶散在，癌巢小，空泡狀，有淋巴結(jié)增生，瘤內(nèi)注射PBS組細(xì)胞大小不一，排列紊亂，核大，空泡狀，核仁深染，未見明顯壞

15、死及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，瘤內(nèi)注射rAD組細(xì)胞大小不一，排列紊亂，核不規(guī)則，核大深染，可見病理分裂相，有灶狀壞死，壞死區(qū)及周圍纖維組織中見少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；瘤內(nèi)注射rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL和rAD-CMV-m4-1BBL兩組動(dòng)物的肝臟出現(xiàn)肝板形態(tài)略不規(guī)整，匯管區(qū)未見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，胞漿淡，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，無明顯壞死的鏡下表現(xiàn)，兩組間差異不明顯，其他各組與正常組之間沒有明顯差異。
　　 11.將轉(zhuǎn)基因的腫瘤細(xì)胞He

16、pal-6接種到小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)rAD-CMV-m4-1BBL的轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞接種后腫瘤沒有生長(zhǎng)，rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL的轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞接種后腫瘤小且生長(zhǎng)緩慢，rAD及野生株腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)建立腫瘤，生長(zhǎng)較快，兩組間大小及生長(zhǎng)速度沒有差異，病理切片CD4及CD8檢查發(fā)現(xiàn)rAD-mTERT-promotor-m4-1BBL轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的CD8陽(yáng)性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，與其它組存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，其它組間差