豬CREB家族基因的克隆及表達研究的初步探討.pdf

1、CREB（cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白）/ATF（激活轉(zhuǎn)錄因子）家族是真核生物中廣泛存在的一類基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子，該家族共同的結(jié)構(gòu)特征是堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）模體。CREB/ATF家族蛋白涉及到細胞的增殖、分化、凋亡、胞外刺激和應(yīng)激反應(yīng)等細胞生命過程。CREB2、CREB3和CREB3L4是ATF/CREB家族中三個重要的成員。
　　 本文以梅山豬為研究對象，首次對豬CREB家族的這三個基因及CREB3L4的剪接體進行了基因克隆，通過

2、PCR擴增獲取基因組序列并對其進行基因結(jié)構(gòu)分析，利用輻射雜種細胞板技術(shù)和半定量RT-PCR等方法進行了基因的染色體定位和組織表達分析：另外還克隆豬CREB3啟動子區(qū)域并構(gòu)建了pGL3熒光素酶報告載體，利用實時定量PCR方法檢測脂多糖刺激后CREB3 mRNA相對表達量，并利用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測脂多糖刺激后CREB3的啟動子活性是否變化。研究結(jié)果如下：
　　 1．擴增得到豬CREB家族三個成員的的cDNA序列，包含全長編碼區(qū)

3、及部分非編碼區(qū)，并對其進行了生物信息學(xué)的分析。其中CREB2編碼區(qū)為1047 bp，編碼378個氨基酸； CREB3編碼區(qū)為1098 bp，編碼375個氨基酸； CREB3L4 varant1和varant2編碼區(qū)分別為1188bp和816bp，分別編碼395和271個氨基酸。在蛋白質(zhì)水平上，CREB2與人、小鼠CREB2分別享有85.8％，71.7％的相似性；CREB3與人、小鼠CREB3分別享有72.6％和65.0％的相似性；CRE

4、B3L4與人、小鼠CREB3L4分別享有82.5％和61.1％的相似性。
　　 2．擴增獲得CREB家族這三個成員的基因組序列并分析它們的基因結(jié)構(gòu)。CREB2基因組長度為2069bp，包含三個外顯子和兩個內(nèi)含子；CREB3基因組長度大約為5.3kb，包含九個外顯子和八個內(nèi)含子；CREB3L4基因組長度大約為6.3kb，包含十個外顯子和九個內(nèi)含子。這三個基因所有的外顯子和內(nèi)含子的交界都符合GT/AG法則。根據(jù)所得到的基因組序列，利

5、用輻射雜種板技術(shù)將CREB2、CREB3和CREB3L4分別定位在5p、1q28和4q。并且通過比對豬-人比較基因組圖譜證實這兩個基因的定位結(jié)果與人相應(yīng)基因在染色體上的位置相對應(yīng)。
　　 3．以梅山豬的脂肪組織、骨骼肌、心、胃、肝、肺、脾、腸、腦、腎、淋巴等十一個組織樣品為材料，利用半定量RT-PCR的方法研究了CREB家族這三個成員在mRNA水平上的組織表達譜。結(jié)果表明CREB2、CREB3和CEEB3L4在組織中廣譜性表達。

6、CREB2和CREB3均在白色脂肪組織、胃、腎肺、小腦、肝臟和淋巴幾個組織中高表達。CEEB3L4 variant1在肝臟和胃中表達量較高，中度表達與小腦中，其次是脾、白色脂肪組織和淋巴組織，然而在骨骼肌和腎中表達量極低。另外，與CEEB3L4 variant1相比，CEEB3L4 variant2普遍在組織中以極低的水平表達，說明CEEB3L4 variant1是組織中CEEB3L4存在的主要形式。
　　 4．為了研究CREB

7、3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，我們克隆得到CREB35’端上游區(qū)域啟動子區(qū)域1926bp，并進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析，發(fā)現(xiàn)在GC box元件上游有4個SP1識別位點、1個NF-κB位點、2個AP1位點和1個AP2位點。進而構(gòu)建插入了此段區(qū)域的熒光素酶報告載體，檢測到此段區(qū)域具有較強的啟動子活性。
　　 5．用濃度為1μg/ml的脂多糖（LPS）分別刺激豬IBRS-2和小鼠RAW263.7細胞，使用qRT-PCR方法檢測CREB3的表達變化。