siRNA抑制STGC3基因表達對NIH3T3細胞生長增殖的影響.pdf

1、目的：STGC3基因是新近克隆的一個候選抑瘤基因。本研究以STGC3基因陽性表達的鼠成纖維細胞系NIH3T3細胞為模型，采用siRNA技術，使NIH3T3細胞的STGC3基因表達下調，觀察STGC3基因表達下調對NIH3T3細胞增殖的影響。 方法：構建針對STGC3基因 mRNA的pSilencer3.1-STGC3-siRNA表達載體，經脂質體轉染，導入NIH3T3細胞，G418篩選，建立穩(wěn)定的pSilencer 3.1- S

2、TGC3-siRNA/NIH3T3細胞系。RT-PCR、Western blotting和免疫細胞化學方法，檢測STGC3基因mRNA和蛋白表達。通過HE染色、繪制生長曲線、軟瓊脂集落形成實驗及流式細胞儀分析，觀察STGC3基因表達下調后，NIH3T3細胞形態(tài)、增殖速度、克隆形成率和細胞周期分布變化。 結果：重組質粒DNA經酶切和測序鑒定，結果均證實pSilencer3.1-STGC3-siRNA表達載體構建成功。將pSilen

3、cer3.1-STGC3-siRNA和pSilencer3.1質粒分別轉染NIH3T3細胞，G418篩選陽性細胞克隆，經RT-PCR、Western blotting及免疫細胞化學方法檢測結果表明，成功建立了STGC3基因表達下調的NIH3T3細胞系。普通光學顯微鏡下觀察，pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3細胞與兩對照組相比，核染色加深，細胞變得細長；細胞生長曲線結果顯示：pSilencer3.1-STGC3

4、-siRNA/NIH3T3細胞較pSilencer3.1/NIH3T3細胞和NIH3T3細胞生長速度快；軟瓊脂集落形成實驗結果證實， pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3組、pSilencer3.1/NIH3T3組和NIH3T3組克隆形成率分別為(6.4±1.0)％、(2.2±0.3)％和(2.1±0.3)％, pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3組克隆形成能力較兩對照組顯著增強；流式

5、細胞儀檢測結果：pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3組較對照組細胞群體中處于S期和G2的細胞數(shù)目增加，G0/G1期細胞數(shù)目減少。 結論： 1．構建了pSilencer3.1-STGC3-siRNA真核表達載體。 2．建立了STGC3基因表達下調的pSilencer3.1-STGC3-siRNA/NIH3T3細胞系。 3．siRNA抑制STGC3基因表達可促進NIH3T3細胞增殖。