細胞質(zhì)M-CSF對NIH 3T3細胞增殖和運動的影響.pdf

1、目的:建立胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定表達M-CSF的細胞系;探討定位在胞質(zhì)內(nèi)的M-CSF對細胞增殖和運動的影響。
　　方法:PCR分別擴增人 M-CSF的胞外活性區(qū)和功能區(qū),連接到胞漿定位載體pCMV/cyto/myc質(zhì)粒,得重組質(zhì)粒pCMV/cyto/myc-h-M-CSF,再將重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞,得到分別穩(wěn)定表達M-CSF的胞外活性區(qū)和功能區(qū)的細胞株。免疫細胞化學(xué)驗證M-CSF蛋白的定位,細胞生長曲線和致傷愈合實驗顯示外源的M-

2、CSF對NIH3T3細胞增殖和運動的影響。考馬斯亮蘭對細胞骨架進行染色。
　　結(jié)果:重組基因的插入片段大小分別與M-CSF的胞外區(qū)和功能區(qū)相符,重組的M-CSF片段無閱讀框移位和突變,綠色熒光蛋白僅定位在NIH3T3細胞質(zhì)內(nèi),表明成功構(gòu)建胞漿定位表達載體 pCMV/cyto/myc-M-CSF-a和pCMV/cyto/myc-M-CSF-d;分別將pCMV/cyto/myc-M-CSF-a和pCMV/cyto/myc-M-CSF-

3、d質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞,并經(jīng)G418篩選后,穩(wěn)定表達M-CSF胞外區(qū)和功能區(qū)的NIH3T3細胞株其倍增時間均短于對照細胞;胞質(zhì)內(nèi)M-CSF誘導(dǎo)NIH3T3細胞微絲重構(gòu)和細胞遷移;M-CSF N末端149個氨基酸殘基組成的功能區(qū)其促NIH3T3細胞增殖和運動活性與M-CSF的胞外區(qū)基本相同。
　　結(jié)論:建立了一個細胞質(zhì)穩(wěn)定表達M-CSF的細胞系;細胞質(zhì)M-CSF能誘導(dǎo)NIH3T3細胞增殖,增強細胞運動能力;M-CSF蛋白的功能區(qū)