轉(zhuǎn)染HIF-1αΔODD基因的NIH3T3細(xì)胞促大鼠移植組織血管化.pdf

1、血管新生在創(chuàng)傷愈合、器官移植及組織工程等領(lǐng)域具有重要作用，它是一個(gè)需要多種細(xì)胞和生長(zhǎng)因子協(xié)同發(fā)揮作用的過(guò)程。
　　如何通過(guò)生物刺激獲得成熟的新生血管一直是令人困擾的難題。以往通過(guò)局部或全身給予VEGF誘導(dǎo)血管形成的方法會(huì)使血管的通透性增高，導(dǎo)致患者血壓降低，而且新生的血管大部分沒(méi)有正常功能。為了解決這一問(wèn)題，一些研究采用多種生長(zhǎng)因子聯(lián)合應(yīng)用的方法，即同時(shí)提供促血管形成的信號(hào)和促血管成熟的信號(hào)，獲得了令人滿意的效果。然而多種生長(zhǎng)因子

2、聯(lián)合應(yīng)用會(huì)增加治療的成本，而且各種因子間的相互作用也沒(méi)有研究清楚。HIF-1α是一種能激活許多缺氧反應(yīng)性基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它具有一個(gè)氧敏感降解區(qū)（ODD），敲除ODD后HIF-1α在常氧下穩(wěn)定，可以調(diào)節(jié)多種生長(zhǎng)因子高表達(dá)。一些研究證實(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)敲除ODD的HIF-1αΔODD基因治療，在多種組織中獲得了大量成熟的新生血管。本課題擬比較HIF-1αΔODD基因和VEGF基因?qū)ρ苄纬傻淖饔谩?br>　　基因治療具有良好的臨床應(yīng)用前景，但是如

3、何安全有效地將目的基因轉(zhuǎn)入宿主體內(nèi)仍是未解的難題。直接注射病毒的方法轉(zhuǎn)染率低，易丟失，還會(huì)引起宿主的免疫反應(yīng)。以細(xì)胞作為目的基因的載體可以克服以上不足，應(yīng)用這一策略治療缺血性疾病獲得了很好的效果。成纖維細(xì)胞易培養(yǎng)且免疫源性低，異種成纖維細(xì)胞在宿主內(nèi)可存活2-8周，這段時(shí)間對(duì)于促血管形成已經(jīng)足夠，而且異種的成纖維細(xì)胞最終會(huì)被宿主排斥，不會(huì)引起血管瘤等腫瘤形成，因此很安全。本課題擬采用異種成纖維細(xì)胞作為基因載體。
　　帶蒂皮瓣移植是臨

4、床常用的組織修復(fù)方法之一，然而皮瓣需要至少3周的時(shí)間才能斷蒂。自體游離脂肪組織移植被用于充填顏面部的凹陷畸形和隆乳等多種手術(shù)，但自體脂肪組織移植存活率低。如能在術(shù)后及時(shí)重建血運(yùn)，則帶蒂皮瓣斷蒂時(shí)間可縮短，脂肪存活率可提高。本課題擬選擇大鼠帶蒂皮瓣轉(zhuǎn)移和自體脂肪移植作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　本課題的研究目的是探討移植轉(zhuǎn)染HIF-1αΔODD基因的NIH3T3細(xì)胞對(duì)縮短大鼠帶蒂皮瓣斷蒂時(shí)間的作用和對(duì)提高自體脂肪移植成活率的作用；通過(guò)觀察NI

5、H3T3細(xì)胞在大鼠體內(nèi)存活的時(shí)間，探討異種成纖維細(xì)胞作為基因載體發(fā)揮短期作用的可能性；通過(guò)觀察皮瓣和脂肪的血管密度和成熟度，比較HIF-1αΔODD基因和VEGF165基因的促血管新生的作用。
　　實(shí)驗(yàn)一：重組慢病毒Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP的構(gòu)建
　　目的：構(gòu)建重組慢病毒Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP,并進(jìn)行鑒定。方法：設(shè)計(jì)引物,在目的基因HIF-1αΔODD的上游引入SmaI酶切位點(diǎn)，下游引入

6、NheI酶切位點(diǎn)，對(duì)質(zhì)粒pCEP4/HIF-1αΔODD進(jìn)行不對(duì)稱PCR，PCR產(chǎn)物跑電泳，切膠回收，用SmaI和NheI雙切，產(chǎn)物跑電泳，切膠回收。用SmaI和NheI雙切中間載體pRRLsin/LacZalpha(+)，回收大片段。產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化，得到pRRLsin/HIF-1αΔODD/EGFP質(zhì)粒。PCR鑒定，酶切鑒定，測(cè)序。將pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pRRLsin/HIF-1αΔODD/EGFP4種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染29

7、3T細(xì)胞，收上清。結(jié)果：PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果符合。結(jié)論：成功構(gòu)建了重組慢病毒Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP。
　　實(shí)驗(yàn)二：重組慢病毒Lenti/VEGF165/EGFP的構(gòu)建 目的:構(gòu)建重組慢病毒Lenti/VEGF165/EGFP,并進(jìn)行鑒定。方法:設(shè)計(jì)引物,在目的基因VEGF165的上游引入SmaI酶切位點(diǎn),下游引入NheI酶切位點(diǎn),對(duì)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/VEGF165進(jìn)行PCR,PCR

8、產(chǎn)物跑電泳,切膠回收,用SmaI和NheI雙切,產(chǎn)物跑電泳,切膠回收。用SmaI和NheI雙切中間載體pRRLsin/LacZ alpha(+),回收大片段。產(chǎn)物連接,轉(zhuǎn)化,得到pRRLsin/VEGF165/EGFP質(zhì)粒。PCR鑒定,酶切鑒定,測(cè)序。將pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pRRLsin/VEGF165/EGFP4種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收上清。結(jié)果:PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果符合。結(jié)論:成功構(gòu)建了重組

9、慢病毒Lenti/VEGF165/EGFP。
　　實(shí)驗(yàn)三：重組慢病毒體外轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞 目的:分別獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HIF-1αΔODD、VEGF165和EGFP基因的NIH3T3細(xì)胞系。方法: Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP、Lenti/VEGF165/EGFP和Lenti/EGFP分別轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞,流式細(xì)胞分選,定量PCR、Western Blot和ELISA檢測(cè)。結(jié)果:定量PCR、Western Blot

10、和ELISA檢測(cè)證實(shí)Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞高表達(dá)小鼠VEGF、bFGF和Ang-1蛋白,Lenti/VEGF165/EGFP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞高表達(dá)人VEGF165蛋白。結(jié)論:獲得了3個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系:Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞、Lenti/VEGF165/EGFP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞和Lenti/EGFP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞。
　　實(shí)驗(yàn)四：

11、觀察NIH3T3細(xì)胞在大鼠體內(nèi)的存活時(shí)間 目的:探知NIH3T3細(xì)胞在大鼠體內(nèi)的存活時(shí)間。方法:將Lenti/EGFP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞和CM-DiI標(biāo)記的NIH3T3細(xì)胞分別注射到大鼠皮下,分別于注射后第1、2、3、4周掀起皮瓣熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果:第1-3周鏡下觀察到數(shù)量基本相同的發(fā)熒光的細(xì)胞,第4周數(shù)量明顯減少。Lenti/EGFP轉(zhuǎn)染組和CM-DiI標(biāo)記組觀察結(jié)果一致。結(jié)論:NIH3T3細(xì)胞在大鼠體內(nèi)的至少可以存活3周。<

12、br>　　實(shí)驗(yàn)五：轉(zhuǎn)染HIF-1αΔODD基因的NIH3T3細(xì)胞大鼠促皮瓣血管化 目的:觀察Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞對(duì)縮短大鼠帶蒂皮瓣斷蒂時(shí)間的作用。方法:將A組Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞、B組Lenti/VEGF165/EGFP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞和C組(對(duì)照組)Lenti/EGFP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞分別注射到大鼠背部帶蒂皮瓣下,并于4天斷蒂,檢測(cè)皮瓣

13、的成活率。通過(guò)計(jì)數(shù)CD31(血管內(nèi)皮標(biāo)志)陽(yáng)性的血管,比較各組的血管密度。通過(guò)計(jì)算SMA(血管平滑肌標(biāo)志)陽(yáng)性的血管的百分比,比較各組的血管成熟度。ELISA檢測(cè)血清中生長(zhǎng)因子含量。結(jié)果:A組和B組大鼠皮瓣4天斷蒂后皮瓣100％成活,C組約40％成活。血管密度A組是C組的3倍,B組是C組的4倍;血管成熟度A組約53％,B組約10％,C組約39％。結(jié)論:移植Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞到大鼠皮瓣下可以促

14、進(jìn)血管新生和成熟,縮短皮瓣斷蒂時(shí)間。
　　實(shí)驗(yàn)六：轉(zhuǎn)染HIF-1αΔODD基因的NIH3T3細(xì)胞促大鼠移植脂肪血管化 目的:觀察Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞對(duì)提高大鼠自體移植脂肪成活率的作用。方法:將A組Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞、B組Lenti/VEGF165/EGFP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞和C組(對(duì)照組)Lenti/EGFP轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞分別混入

15、大鼠自體脂肪顆粒中,脂肪移植到背側(cè)皮下,于6個(gè)月后檢測(cè)移植脂肪的成活率、通過(guò)HE染色和免疫熒光染色檢測(cè)各組的血管密度。結(jié)果:A、B、C三組的移植脂肪組織存活率分別為99.3％,76.7％,20.0％。血管密度A組是C組的5倍,A、B兩組間無(wú)顯著差異。結(jié)論:移植轉(zhuǎn)染Lenti/HIF-1αΔODD/EGFP的NIH3T3細(xì)胞對(duì)移植脂肪組織的血運(yùn)重建有明顯的促進(jìn)作用,提高了移植脂肪的成活率,其作用優(yōu)于移植轉(zhuǎn)染Lenti/VEGF165/EG