轉(zhuǎn)染人骨形成蛋白2基因共培養(yǎng)條件下NIH3T3細(xì)胞生物學(xué)性狀觀察.pdf

1、本研究擬將人骨形成蛋白2真核表達(dá)載體pcDNA3.1-B2轉(zhuǎn)染入小鼠成纖維細(xì)胞系細(xì)胞(NIH3T3細(xì)胞)，建立能穩(wěn)定表達(dá)BMP2的細(xì)胞系，并利用細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)Transwell，觀察轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)表達(dá)的分泌型BMP2對NIH3T3細(xì)胞骨化分化的影響。以探討B(tài)MP2基因治療在牙周組織工程方面的意義。 實(shí)驗(yàn)一pcDNA3.1-B2真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定及穩(wěn)定表達(dá)BMP2細(xì)胞系的建立 目的:通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，建立穩(wěn)定表達(dá)BMP2的成纖維

2、細(xì)胞系。 材料和方法將:pcDNA3.1-B2用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后，經(jīng)1﹪瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并檢測其攜帶目的基因的核酸序列。將經(jīng)過鑒定的pcDNA3.1-B2真核表達(dá)質(zhì)粒通過高效的陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染入NIH3T3細(xì)胞中，并用G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。RT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測hBMP2基因的轉(zhuǎn)錄和BMP2蛋白在胞外的表達(dá)。 結(jié)論:通過轉(zhuǎn)基因手段轉(zhuǎn)染入hBMP2基因的成纖維細(xì)胞

3、具有穩(wěn)定表達(dá)BMP2蛋白的作用，并能分泌BMP2蛋白于胞外。 實(shí)驗(yàn)二轉(zhuǎn)染hBMP2基因誘導(dǎo)表達(dá)的分泌型BMP2對成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 目的:觀察轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)表達(dá)的分泌型BMP2對成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。 材料和方法:利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)將NIH3T3細(xì)胞與轉(zhuǎn)染hBMP2基因細(xì)胞(B2-3T3細(xì)胞)共培養(yǎng)十天后，下層NIH3T3細(xì)胞經(jīng)3﹪戊二醛固定后制備超薄切片，再經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后，利用

4、透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)論:轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)表達(dá)的分泌型BMP2使成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出骨細(xì)胞系細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征，且細(xì)胞的分泌功能增強(qiáng)。 實(shí)驗(yàn)三轉(zhuǎn)染hBMP2基因誘導(dǎo)表達(dá)的分泌型BMP2對成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響 目的:觀察轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)表達(dá)的分泌型BMP2對成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響。 材料和方法:利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)將NIH3T3細(xì)胞與轉(zhuǎn)染hBMP2基因細(xì)胞(B2-3T3細(xì)胞)共培養(yǎng)

5、十天后，超聲破碎下層NIH3T3細(xì)胞，以對-硝基苯磷酸二鈉為底物，在405nm處測定其堿性磷酸酶活性，將測定的OD值進(jìn)行單因素方差分析和PostHocTests檢驗(yàn)。 結(jié)論:轉(zhuǎn)染hBMP2基因誘導(dǎo)表達(dá)的分泌型BMP2具有上調(diào)成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶活性的作用。 實(shí)驗(yàn)四轉(zhuǎn)染hBMP2基因誘導(dǎo)表達(dá)的分泌型BMP2對成纖維細(xì)胞骨化標(biāo)志物骨鈣蛋白表達(dá)的影響 目的:觀察轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)表達(dá)的分泌型BMP2對成纖維細(xì)胞骨化標(biāo)志物骨鈣蛋

6、白表達(dá)的影響。 材料和方法:利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)將NIH3T3細(xì)胞與轉(zhuǎn)染hBMP2基因細(xì)胞(B2-3T3細(xì)胞)共培養(yǎng)十天后，下層NIH3T3細(xì)胞用丙酮固定后，經(jīng)SABC法免疫組化染色后觀察其骨鈣蛋白(OCN)的表達(dá)情況。 結(jié)論:轉(zhuǎn)染hBMP2基因誘導(dǎo)表達(dá)的分泌型BMP2具有誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)骨化標(biāo)志物骨鈣蛋白的作用。 綜上所述，本研究采用陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑可將外源性hBMP2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入NIH3T