擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫響應(yīng)中的功能研究.pdf

1、干旱、鹽脅迫和酸性土壤中的鋁毒害是造成作物減產(chǎn)的主要非生物逆境，而植物響應(yīng)這些脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及分子調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究和拓展。轉(zhuǎn)錄因子在植物信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了極其重要的作用，它們一方面接受被感知的信號(hào)進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)，另一方面又能成為一個(gè)節(jié)點(diǎn)，協(xié)調(diào)不同信號(hào)途徑之間的相互作用。因此，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子逆境響應(yīng)的功能研究是我們從分子水平上認(rèn)識(shí)植物如何適應(yīng)惡劣環(huán)境的重要基礎(chǔ)。WRKY家族是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其調(diào)控范圍涵蓋植物

2、生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)等多種生理活動(dòng)。盡管WRKY蛋白在生物脅迫反應(yīng)中已得到了廣泛的研究，但其在非生物脅迫應(yīng)答中的研究還處于起步階段。本文對(duì)擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的33個(gè)WRKY基因進(jìn)行表達(dá)分析，最終篩選到了2個(gè)WRKY（WRKY46和WRKY41）參與快速響應(yīng)過(guò)氧化氫和鎘的處理，隨后對(duì)這2個(gè)基因的功能進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。主要結(jié)果分為以下四個(gè)方面:
　　1、WRKY46調(diào)控滲透脅迫響應(yīng)以及光依賴的氣孔運(yùn)動(dòng)<

3、br>　　在多種非生物脅迫的處理中，WRKY46對(duì)水分脅迫（干旱、滲透和鹽脅迫）的響應(yīng)尤為明顯。干旱和鹽脅迫在短時(shí)間內(nèi)便可顯著提高WRKY46的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平。WRKY46 T-DNA插入突變體對(duì)干旱和鹽脅迫十分敏感，表現(xiàn)為突變體地上部生長(zhǎng)差于野生型。然而，WRKY46過(guò)表達(dá)株系在平板處理?xiàng)l件下（封閉的環(huán)境）對(duì)鹽和滲透脅迫有較高的耐性，但在土培條件下（開闊的環(huán)境）卻對(duì)干旱和鹽脅迫非常敏感。原因是WRKY46過(guò)表達(dá)植株的葉片具有較高的

4、失水率。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，WRKY46的過(guò)表達(dá)可以抑制保衛(wèi)細(xì)胞中ROS(reactive oxygenspecies)的產(chǎn)生，從而破壞ABA(abscisic acid)誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過(guò)程。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)WRKY46受光的誘導(dǎo)表達(dá)，并且其在保衛(wèi)細(xì)胞中的表達(dá)不受干旱等處理的影響。WRKY46在保衛(wèi)細(xì)胞中的主要作用可能是參與光依賴的氣孔打開過(guò)程。基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，WRKY46調(diào)控了一系列參與細(xì)胞滲透保護(hù)和氧化還原平衡的基因的表達(dá)。此外，W

5、RKY46也通過(guò)調(diào)控QQS(QUA-QUINESTARCH)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞中的淀粉代謝，從而調(diào)節(jié)氣孔的打開過(guò)程。
　　因此，WRKY46在脅迫應(yīng)答和氣孔調(diào)控中發(fā)揮了兩種獨(dú)立的作用:一是調(diào)控干旱和鹽脅迫下植物細(xì)胞的滲透保護(hù)和降低氧化脅迫;二是通過(guò)調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞中淀粉的代謝來(lái)調(diào)節(jié)氣孔的打開。
　　2、WRKY46調(diào)控鹽和滲透脅迫下的側(cè)根發(fā)育
　　組織定位分析表明，WRKY46在側(cè)根發(fā)育初期的根原基以及成熟側(cè)根的中柱

6、中表達(dá)。WRKY46的功能缺失導(dǎo)致植株在鹽和滲透脅迫下的側(cè)根發(fā)育受到明顯的抑制（相對(duì)于野生型）。相反，WRKY46的過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)植株在脅迫下的側(cè)根發(fā)育。外源添加生長(zhǎng)素可以極大地回復(fù)wrky46突變體在脅迫下的側(cè)根表型，而生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑(TIBA)同時(shí)抑制野生型和WRKY46過(guò)表達(dá)植株在脅迫下的側(cè)根發(fā)育，說(shuō)明WRKY46對(duì)側(cè)根的調(diào)控依賴生長(zhǎng)素。對(duì)WRKY46的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，WRKY46在根中的表達(dá)受到ABA的顯著抑制，但同時(shí)在

7、鹽或滲透脅迫下，WRKY46也受到ABA以外的信號(hào)調(diào)控。DR5(∶)GUS在wrky46突變體中的表達(dá)明顯低于在野生型中的表達(dá)。與此吻合的是，突變體根中游離IAA的含量出現(xiàn)降低，而橋連IAA的含量有所提高（相對(duì)于野生型）;而WRKY46過(guò)表達(dá)株系的IAA含量變化與突變體正好相反?；虮磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn)，WRKY46在鹽或滲透脅迫下調(diào)控ABI4(ABAINSENSITIVE4)和參與生長(zhǎng)素橋連的相關(guān)基因的表達(dá)。染色質(zhì)免疫共沉淀進(jìn)一步證實(shí)WRKY

8、46可以直接結(jié)合到這些基因的啟動(dòng)子上。以上結(jié)果證明，WRKY46通過(guò)調(diào)控ABA信號(hào)途徑和生長(zhǎng)素內(nèi)穩(wěn)態(tài)進(jìn)而參與前饋抑制鹽或滲透脅迫對(duì)植物側(cè)根的抑制。
　　3、WRKY46調(diào)控鋁誘導(dǎo)的蘋果酸分泌
　　ALMT1編碼蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是擬南芥一關(guān)鍵耐鋁基因。我們發(fā)現(xiàn)在基因芯片中，ALMT1的表達(dá)明顯受到WRKY46的抑制。在鋁處理?xiàng)l件下，WRKY46的表達(dá)在處理3小時(shí)后出現(xiàn)顯著的下調(diào)，而ALMT1的表達(dá)受鋁處理的誘導(dǎo)。而且在組織表達(dá)

9、上，WRKY46和ALMT1在擬南芥根中存在共同的表達(dá)區(qū)域，即兩者均在根的中柱表達(dá)，說(shuō)明兩者可能存在調(diào)控關(guān)系。表型分析發(fā)現(xiàn)，wrky46突變體在鋁處理下表現(xiàn)出較高的鋁耐性（相對(duì)于野生型），并且突變體含有較低的根系鋁含量。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ALMT1在wrky46突變體中的表達(dá)明顯提高，從而增強(qiáng)突變體根系蘋果酸的分泌，緩解鋁毒。煙草中的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，WRKY46可以抑制ALMT1的表達(dá)。利用酵母單雜和染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)，WR

10、KY46可以直接結(jié)合到ALMT1啟動(dòng)子中的W-box上。以上結(jié)果證明，WRKY46是關(guān)鍵耐鋁基因ALMT1的負(fù)調(diào)控因子，WRKY46的功能缺失提高根系蘋果的分泌，從而降低根系的鋁含量，提高植株對(duì)鋁的耐性。
　　4、WRKY41調(diào)控種子休眠
　　盡管WRKY41也能快速響應(yīng)過(guò)氧化氫和鹽脅迫的誘導(dǎo)，但WRKY41的功能缺失突變體wrky41對(duì)這些處理的響應(yīng)與野生型無(wú)明顯差異。研究發(fā)現(xiàn)，WRKY41主要在種子中表達(dá)。WRKY41的

11、功能缺失導(dǎo)致種子的初生休眠和熱脅迫下產(chǎn)生的次生休眠都顯著降低，并且wrky41的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)對(duì)ABA不敏感。而這種表型與ABI3(ABA INSENSITIVE3)的功能缺失十分相似?；虮磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn)，WRKY41的缺失明顯降低ABI3在種子發(fā)育以及萌發(fā)過(guò)程中的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)WRKY41可以提高ABI3的表達(dá)。而且，在wrky41中過(guò)表達(dá)ABI3可以完全回復(fù)突變體種子休眠相關(guān)的表型。凝膠阻滯和染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明，WRKY41