草魚(yú)三個(gè)C1q相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、草魚(yú)是中國(guó)乃至世界最重要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類之一,具有悠久的養(yǎng)殖歷史。但草魚(yú)養(yǎng)殖病害頻發(fā),草魚(yú)呼腸孤病毒所導(dǎo)致的草魚(yú)病毒性出血病給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大損失。迄今為止,有效預(yù)防這種傳染病仍然十分困難,傳統(tǒng)方法有其局限性。通過(guò)選育出抗病力強(qiáng)的草魚(yú)新品種,再結(jié)合已有的預(yù)防和治療方式來(lái)增強(qiáng)草魚(yú)抵抗疾病傳染的能力,不失為一條有效的路徑。補(bǔ)體系統(tǒng),作為先天性免疫中的一類重要和保守的體系,為機(jī)體提供了快速和高效地清除入侵微生物的途徑。C1q是補(bǔ)體經(jīng)典途徑的目

2、標(biāo)識(shí)別蛋白,除能夠激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑外,還具有參與機(jī)體免疫的多種功能。本研究克隆了草魚(yú)三個(gè)C1q相關(guān)基因, C1qB、C1qC以及C1q-like,分析了它們的理化性質(zhì)、氨基酸結(jié)構(gòu),比較了它們的同源性,研究它們?cè)诓蒴~(yú)不同發(fā)育過(guò)程、不同組織及其受草魚(yú)呼腸孤病毒感染后的表達(dá)情況,取得了如下結(jié)果:
　　1.通過(guò)同源克隆方式得到草魚(yú)C1qB和C1qC基因中間片段,從本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的草魚(yú)頭腎均一化文庫(kù)中獲得C1q-like基因部分cDNA片段

3、;進(jìn)而采用RACE技術(shù)獲得這3個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)序列,分別為939bp,916bp,1202bp;分別含有編碼243(729bp),244(732bp),248(744bp)個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框,N端分別含有26,23,22個(gè)氨基酸信號(hào)肽序列。
　　2.BLAST分析發(fā)現(xiàn),草魚(yú)C1qB,C1qC和C1q-like都是較為保守的蛋白家族成員,草魚(yú)與斑馬魚(yú)的C1qB、C1qC氨基酸序列相似度最高,分別達(dá)到67％、71%;草魚(yú)C1q-

4、like與斑馬魚(yú)C1qtnf5氨基酸序列相似度最高;選取各自基因不同物種的氨基酸序列,通過(guò)MEGA5.0軟件,使用NJ方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),發(fā)現(xiàn)草魚(yú)與其它硬骨魚(yú)類的親緣關(guān)系最近,這些結(jié)果都支持了傳統(tǒng)的進(jìn)化理論,反應(yīng)了其實(shí)際的親緣關(guān)系。
　　3.多序列比對(duì)和蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),C1qB、C1qC基因都包含有三個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域:N-端信號(hào)肽,膠原結(jié)構(gòu)域和C-端球狀結(jié)構(gòu)域,且其氨基酸序列中與鏈間及鏈內(nèi)的二硫鍵結(jié)合有關(guān)的四個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)一

5、致,并在不同物種中高度保守。但他們的氨基酸序列一致度并不高,表明他們的功能可能具有一定差異性。C1q-like基因具有與補(bǔ)體C1q高度同源的C-端球狀結(jié)構(gòu)域和與TNF-α相似的THD結(jié)構(gòu)域兩大C1q/TNF家族成員重要結(jié)構(gòu)部分。
　　4.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)健康草魚(yú)各組織及使用草魚(yú)呼腸孤病毒誘導(dǎo)后3個(gè)基因的表達(dá)譜,結(jié)果顯示:3個(gè)基因在所有被檢測(cè)組織中均有表達(dá),表明他們可能在草魚(yú)體內(nèi)發(fā)揮廣泛的作用;3個(gè)基因均在脾臟、中腎、

6、頭腎等免疫器官內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá),也體現(xiàn)了其在免疫中起到重要作用。經(jīng)誘導(dǎo)后,3個(gè)基因的大多數(shù)組織均出現(xiàn)了在顯著上調(diào)的現(xiàn)象,尤其是免疫相關(guān)組織多在感染早期出現(xiàn)上調(diào)后呈下降趨勢(shì),此外,在皮、腮、腸等粘膜組織中也發(fā)現(xiàn)有參與免疫反應(yīng)的跡象。分析健康草魚(yú)和病毒注射后草魚(yú)體內(nèi)3個(gè)基因的表達(dá)情況,表明草魚(yú)呼腸孤病毒可以影響草魚(yú)體內(nèi)的C1q相關(guān)基因的表達(dá)情況,從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的影響。
　　5.為了解C1qB、C1qC和C1q-like基因?qū)Σ蒴~(yú)的胚胎

7、發(fā)育所起到的作用,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)顯示:在卵子中均檢測(cè)到3個(gè)基因的表達(dá),這表明他們可能遺傳于母本;3個(gè)基因均在胚胎發(fā)育早期及檢測(cè)到表達(dá),表明他們?cè)谂咛グl(fā)育過(guò)程中具有重要的作用。其中草魚(yú)C1qB與C1q-like基因的表達(dá)譜較為相似,在胚胎發(fā)育的早期具有較高的表達(dá)量,表明他們可能參與到卵子發(fā)生、受精的過(guò)程中。
　　通過(guò)以上研究結(jié)果可見(jiàn),3種基因均在免疫器官中的表達(dá)量較高,且受到草魚(yú)呼腸孤病毒誘導(dǎo)后表達(dá)量都出現(xiàn)顯