與茶葉香氣形成相關(guān)的三個(gè)內(nèi)源糖苷酶基因的克隆和原核表達(dá).pdf

1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特另tlDi：l以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝立二。日、o學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使

2、用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文件，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū))。學(xué)位論文作者簽名：——簽字日期：年月日學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：通信地址：指導(dǎo)教師簽名：簽字日期：年月日電話：郵編：摘要茶樹(shù)是我圍重要的經(jīng)濟(jì)作物，香氣是衡量茶葉品質(zhì)好壞

3、的關(guān)鍵因素。條樹(shù)葉片中的單萜烯醇和芳香族醇等揮發(fā)性組分豐要是以糖苷形式存在，且以櫻草糖苷和葡萄糖苷為豐。糖苷類(lèi)物質(zhì)是茶樹(shù)在牛長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中形成的次級(jí)代謝產(chǎn)物，與這類(lèi)糖苷的合成與水解相關(guān)的酶類(lèi)豐要有B一櫻草糖苷酶、B一葡萄糖苷酶I、B一葡萄糖苷酶II等。糖苷類(lèi)香氣前體被內(nèi)源糖苷酶水解后釋放出的揮發(fā)性苷元，不儀是茶葉香氣的物質(zhì)基礎(chǔ)，也參與條樹(shù)對(duì)病蟲(chóng)害的防御反應(yīng)?？寺〖氨磉_(dá)茶葉香氣形成途徑中的關(guān)鍵內(nèi)源酶類(lèi)，對(duì)于深入了解茶葉香氣形成機(jī)理，豐富和完

4、善茶葉加工和茶園管理理論與技術(shù)，促進(jìn)抗病與高香茶樹(shù)良種的培育都具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本文利用課題組前期從茶樹(shù)葉片中純化出兩種與茶葉葡萄糖苷類(lèi)香氣前體水解相關(guān)的B一葡萄糖苷酶的cDNA全長(zhǎng)序列，以及NCBI網(wǎng)站GeneBank中已登錄的B一櫻草糖苷酶序列，分別設(shè)計(jì)了原核表達(dá)引物，采用RT—PCR技術(shù)，從茶樹(shù)葉片中分別對(duì)各基因的編碼區(qū)進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增。將擴(kuò)增片段克隆到pMDl8T上并進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果分別與原序列比較，顯示克隆得到的

5、序列一致性達(dá)到99％以上。通過(guò)牛物信息學(xué)分析，茶樹(shù)B一櫻草糖苷酶(Pri)基因cDNA全長(zhǎng)序列為1729bp，開(kāi)放閱讀框1524bp，編碼507個(gè)氨基酸，分子量為5704kD；13一葡萄糖苷酶I(GluI)基因cDNA全長(zhǎng)序列為2337bp，開(kāi)放閱讀框1896bp，編碼632個(gè)氨基酸，分子量為6915kD；3葡萄糖苷酶II(GluII)基因cDNA全長(zhǎng)序列為2215bp，開(kāi)放閱讀框1887bp，編碼629個(gè)氨基酸，分子量為6887kD。

6、系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，這三個(gè)內(nèi)源糖苷酶基因都與已知的gglucosidase基因親緣關(guān)系較近，其中GluI和GluⅡ與葡萄中的gglucosidase基因相似性最高，而Pri與茶樹(shù)中的13glucosidase基因相似性最高，并且與GluI和GluII關(guān)系較遠(yuǎn)。茶樹(shù)內(nèi)源糖苷酶相關(guān)基因在原核中表達(dá)，通過(guò)選用表達(dá)載體pET一32a()和宿主菌Rosetta(DE3)pLysS對(duì)茶樹(shù)中B一櫻草糖苷酶(Pri)、3葡萄糖苷酶I(GluI)、3葡萄糖