原薯蕷皂苷糖苷酶-1型的特性及其基因的克隆與表達(dá).pdf

1、薯蕷屬植物中的主要活性成分是甾體皂苷，但天然的甾體皂苷常常以低活性的多糖基形式存在，不易被人體吸收。為制備高活性的、易吸收的低糖基甾體皂苷，本文采用微生物酶法轉(zhuǎn)化穿龍薯蕷中的甾體皂苷，并研究了其特異性的甾體皂苷糖苷酶的分離純化、酶性質(zhì)以及基因的克隆和表達(dá)。
　　本研究首先采用乙醇浸提法對(duì)穿龍薯蕷植物中總皂苷進(jìn)行提取，并對(duì)提取物進(jìn)行脫脂、脫糖處理。從4kg穿龍薯蕷植物干燥根中共提取得到了250g的總皂苷，得率為6.3％。通過硅膠柱層

2、析法和制備色譜法，從總皂苷中分離純化得到了兩種主要甾體皂苷，結(jié)構(gòu)經(jīng)鑒定分別為：26-O-β-D-吡喃葡萄糖基25(R)-22-羥基-呋甾-△5(6)-烯-3β,26-二羥基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷（原薯蕷皂苷），薯蕷皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷（薯蕷皂苷）。
　　研究了甾體皂苷酶的生

3、產(chǎn)菌，篩選獲得了轉(zhuǎn)化穿龍薯蕷總皂苷效果較好的米曲霉（DLFCC-38），其粗酶液幾乎完全轉(zhuǎn)化穿龍薯蕷總皂苷，主要生成薯蕷次皂苷A、纖細(xì)皂苷，以及一定量的薯蕷皂苷元。以薯蕷次皂苷A的產(chǎn)量為目標(biāo)，對(duì)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化，最佳條件為：最佳誘導(dǎo)物為穿龍薯蕷提取物，最佳誘導(dǎo)物濃度為2%（v/v），在30℃條件下發(fā)酵72h。其次，對(duì)酶轉(zhuǎn)化的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最佳酶反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)體系pH5.0，反應(yīng)時(shí)間9h，反應(yīng)體系中

4、底物最終濃度20mg/ml。在此基礎(chǔ)之上，米曲霉（DLFCC-38）大量發(fā)酵制備粗酶液，批量定向酶解制備低糖基甾體皂苷。總皂苷160g經(jīng)酶轉(zhuǎn)化后共制備得到產(chǎn)物粗品117g，產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析法分離純化，得到3種單體皂苷成分，分別為：60.3g的薯蕷次皂苷A，得率為51.5%；纖細(xì)皂苷11.54g，得率為9.86%；3.01g的薯蕷皂苷元，得率為2.57%。
　　采用分子篩層析法和離子交換層析法，對(duì)米曲霉（DLFCC-38）誘導(dǎo)產(chǎn)粗酶

5、液進(jìn)行分離純化。經(jīng)三次柱法層析，分離得到了原薯蕷皂苷糖苷酶的純酶。經(jīng)SDS-PAGE法測(cè)定，該酶的分子量約為55kDa。酶反應(yīng)的最適溫度和pH分別為50℃和5.0，酶活力在60℃以下，pH為3.0-8.0范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。K+、Na+、Mg2+、Ca2+四種金屬離子對(duì)酶活力幾乎沒有影響；Zn2+對(duì)酶活力具有一定的抑制作用；而低濃度的Cu2+和Fe3+對(duì)酶活力都有明顯的抑制作用。
　　純化得到的原薯蕷甾體皂苷糖苷酶，能水解原薯蕷皂苷上

6、的26-O-β-D-葡萄糖基生成薯蕷皂苷，然后進(jìn)一步水解薯蕷皂苷的3-O-α-L-(1→4)-鼠李糖基生成薯蕷次皂苷 A。該酶水解原薯蕷皂苷葡萄糖基的Km=4.59mM，Vmax=3.86mM/h,水解薯蕷皂苷鼠李糖基的Km=42.6mM，Vmax=0.15mM/h。此外，該酶還能水解對(duì)硝基苯基-α-D-半乳糖苷（pNP-α-D-Gal）、對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（pNP-β-D-Glc）和對(duì)硝基苯基-β-D-半乳糖苷（pNP-β-

7、D-Gal）。該酶呈現(xiàn)出新的水解特性，不同于國際酶學(xué)委員會(huì)公布的184種糖苷酶（一種糖苷酶只能水解一種糖苷鍵），也不同于其他已報(bào)道過的甾體皂苷糖苷酶，是一種新酶，將其命名為原薯蕷皂苷糖苷酶-1型（protodioscin-Glycosidase-1，PGase-1）。
　　采用RT-PCR技術(shù)以及RACE技術(shù)，對(duì)原薯蕷皂苷酶-1型的基因全長序列進(jìn)行調(diào)取。該酶基因全長為1725bp，包含一個(gè)1497bp的開放閱讀框（ORF），編碼4

8、98個(gè)氨基酸，N端前20個(gè)氨基酸序列為信號(hào)肽序列。通過亞克隆技術(shù)，將原薯蕷皂苷糖苷酶-1型基因重組至真核表達(dá)載體pPIC9K，并電轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母GS115。重組酵母菌誘導(dǎo)表達(dá)的酶液具有原薯蕷皂苷糖苷酶-1型的酶活力，且最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為144h、甲醇的最終濃度為0.5%。經(jīng)SDS-PAGE分析，誘導(dǎo)表達(dá)酶的分子量約為55kDa，與野生型原薯蕷皂苷糖苷酶-1型的分子量55kDa相近。這說明原薯蕷皂苷糖苷酶-1型基因在畢赤酵母中成功的