陸地棉三個WRKY基因的克隆及表達特性分析.pdf

1、WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一類參與多種脅迫反應的誘導型轉(zhuǎn)錄因子，因其N-端含有由WRKYGQK組成的高度保守氨基酸序列而得名，它能夠與(T)(T)TGAC(C/T)序列(W-box)發(fā)生特異性作用，調(diào)節(jié)啟動子中含W-box元件的調(diào)節(jié)基因和/或功能基因的表達，從而參與植物的各種防衛(wèi)反應，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，植物代謝以及信號轉(zhuǎn)導中的調(diào)控等。目前雖然對擬南芥、煙草及水稻中的WRKY基因研究較多，但迄今為止有關(guān)棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子的報道卻很少。本實驗擬

2、在棉花中獲得和抗旱和耐鹽相關(guān)的WRKY基因，為棉花育種奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究以棉花葉片作為實驗材料，利用電子克隆和RT-PCR的方法克隆了陸地棉中三個新的WRKY因，即GhWRKY4、GhWRKY5和GhWRKY6，并對其進行了序列分析及表達特性分析。具體結(jié)果如下：
　　 1.以NCBI上登錄的擬南芥74條擬南芥WRKY因cDNA序列為種子序列，BLAST搜索棉花EST數(shù)據(jù)庫。在此基礎(chǔ)上，將部分重疊且高度同源的棉花ES

3、T序列進行拼接，以拼接的重疊群為種子序列重復進行搜索和拼接，直到重疊群不能繼續(xù)延伸為止。利用ORFfinder軟件進行開放閱讀框分析，利用primer5.0設(shè)計特異引物進行PCR擴增，以陸地棉品種山農(nóng)圣雜3號為材料，結(jié)果共有4對引物擴增出目的條帶。測序分析發(fā)現(xiàn)其中一個為NCBI已經(jīng)收錄的GhWRKY2基因，另外三個為新的陸地棉WRKY基因，分別命名為GhWRKY4、GhWRKY5和GhWRKY6，并提交到GeneBank數(shù)據(jù)庫中。GhW

4、RKY4的GeneBank登錄號為JQ081265，基因全長787bp，開放閱讀框共758bp，編碼252個氨基酸；GhWRKY5的GeneBank登錄號為JQ081266，基因全長865bp，開放閱讀框共522bp，編碼173個氨基酸；GhWRKY6的GeneBank登錄號為JQ081267，基因全長681bp，開放閱讀框共552bp，編碼183個氨基酸。
　　 2.生物信息學分析發(fā)現(xiàn)這三個WRKY蛋白均含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域

5、，鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型，因此它們都屬于WRKY家族的第Ⅱ類。用Protparam預測這三個棉花WRKY蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明這三個WRKY蛋白均為不穩(wěn)定蛋白；用ProtCompVersion進行亞細胞定位發(fā)現(xiàn)這三個WRKY蛋白均位于細胞核內(nèi)；用ProtScale對棉花WRKY氨基酸序列的疏水性/親水性進行預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三個蛋白均為親水性蛋白；用CBS的Protfun軟件預測WRKY編碼蛋白的功能，WRKY4蛋白具有轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生

6、長因子功能；WRKY5蛋白具有轉(zhuǎn)錄功能；WRKY6蛋白具有轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、免疫應答、生長因子功能。
　　 3.運用RT-PCR分析在不同組織中的表達，結(jié)果表明這三個WRKY基因均在葉片中表達量最高。用250mmol/LNaCl和20％PEG6000模擬鹽脅迫和干旱脅迫，分不同時間段來處理棉花幼苗，檢測GhWRKY4、GhWRKY5和GhWRKY6的表達情況。通過實時熒光定量PCR分析鹽脅迫和干旱脅迫下的基因表達，結(jié)果顯示GhWR