陸地棉光合系統(tǒng)ⅡPsbR基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、背景：新疆是我國(guó)最重要的棉花生產(chǎn)基地之一，而干旱、冷害、鹽漬等因素一直是限制棉花產(chǎn)量重要因素。光合系統(tǒng)Ⅱ在植物光合作用中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)在應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫中扮演著重要角色。PsbR蛋白是光合系統(tǒng)Ⅱ中的一個(gè)小分子蛋白，近年來的研究表明PsbR在光合系統(tǒng)Ⅱ的組裝等過程中發(fā)揮著重要作用。
　　目的：為了提高棉花的光合作用效率，本實(shí)驗(yàn)以棉花（陸地棉）為研究材料對(duì)光合系統(tǒng)Ⅱ中的PsbR基因進(jìn)行克隆，然后進(jìn)行序列與功能的初步探索，以期為提高

2、棉花光合作用效率奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：本研究以擬南芥光合系統(tǒng)Ⅱ PsbR蛋白序列作為探針序列對(duì)棉花 EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性檢索，然后下載同源性序列并利用CAP3軟件拼接，采用Primer Premier5.0軟件對(duì)拼接序列設(shè)計(jì)引物，通過RT-PCR的方法從棉花葉片擴(kuò)增目的基因序列，然后采用不同的生物學(xué)軟件對(duì)基因序列信息進(jìn)行分析。采用實(shí)時(shí)熒光定量的方法對(duì)棉花根、莖、葉、花、子房與纖維不同組織中的基因相對(duì)表達(dá)進(jìn)行分析；利用酶切的方

3、法構(gòu)建了植物表達(dá)載體PZP35S-GhPsbR并轉(zhuǎn)入野生型擬南芥和煙草中；通過抗生素篩選及 PCR方法檢測(cè)獲得的轉(zhuǎn)化植株，并對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行了光合與熒光指標(biāo)的測(cè)定。
　　結(jié)果：⑴通過電子克隆得到一個(gè)699bp棉花PsbR基因的序列，經(jīng)RT-PCR和測(cè)序驗(yàn)證后，將其ORF序列提交到Genbank，獲得序列登錄號(hào)為KF944428；預(yù)測(cè)該基因編碼139個(gè)氨基酸，蛋白分子量為14.26kDa；⑵多序列比對(duì)結(jié)果顯示，棉花PsbR蛋白與

4、牧豆樹、馬鈴薯等具有較高的相似性，與蕪菁、菠菜等的相似率較低；在進(jìn)化關(guān)系上，棉花PsbR蛋白與葡萄、蓖麻、楊樹等親緣關(guān)系上較近；與黃瓜、蕪菁、煙草等進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)；⑶實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果表明 PsbR基因在棉花不同組織中均表達(dá)，但不同組織中表達(dá)水平不同，在葉片中表達(dá)量最高；⑷分別采用4℃、NaCl、ABA和PEG6000四種方式處理后，棉花幼苗葉中的PsbR基因的表達(dá)水平都發(fā)生了不同程度的下降，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)不同脅迫處理下GhPsbR基因的

5、相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)出先略微上升隨后下降的趨勢(shì)。⑸構(gòu)建了植物過表達(dá)載體 PZP35S-GhPsbR，并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化野生煙草和擬南芥，經(jīng)抗生素篩選與PCR鑒定，共獲得了12株轉(zhuǎn)基因煙草和4株擬南芥植株，轉(zhuǎn)基因植株在表型上與非轉(zhuǎn)基因植株沒有明顯差異。光合與熒光指標(biāo)的測(cè)定和研究結(jié)果也表明，正常生長(zhǎng)條件下在煙草植株中過表達(dá)GhPsbR基因?qū)煵萦酌绲墓夂吓c熒光指標(biāo)的影響均不顯著。
　　結(jié)論：從棉花葉片中克隆得到了GhPsbR基因cDNA序列，