‘黃花水仙2號’三個WD40相關(guān)基因克隆及表達分析.pdf

1、中國水仙為三倍體，長期以鱗莖無性繁殖，其栽培品種退化趨勢明顯，抗逆性減弱。而隨著城市化進程的不斷推進，可以用于栽種水仙的良田大幅減少。因此，提高中國水仙的抗性，使其能夠適應(yīng)較為復(fù)雜的栽培環(huán)境，對中國水仙未來的持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。本研究從福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院水仙課題組已獲得的多花水仙花瓣抑制消減雜交 cDNA文庫中篩選得到‘黃花水仙2號’的3個的編碼WD40蛋白的基因片段NtWD1、NtWD2、NtWD3，通過RT-PCR和RACE技術(shù)克隆

2、其cDNA全長。同時利用熒光定量PCR對上述三者和一個已知基因NtWD40進了不同組織部位中及七種非生物逆境下的表達分析，為中國水仙的種質(zhì)改良和抗逆品種的選育提供參考。
　　黃花水仙2號NtWD1、NtWD2、NtWD3基因的克隆通過RT-PCR和RACE技術(shù)從黃花水仙2號的花瓣中克隆得到了NtWD1基因cDNA全長及NtWD2、NtWD3基因的5’端部分。NtWD1基因包含一個3372bp的開放閱讀框，共編碼1126個氨基酸。N

3、端含有一個LisH（lissencephaly homology）和一個CLTH（C-terminal to LisH）結(jié)構(gòu)域，中部和C端共有11個WD40結(jié)構(gòu)域。其二級結(jié)構(gòu)具有TPL/TPR（TOPLESS/TOPLESS-RELATED）類共抑制因子的特征。三維構(gòu)象模擬顯示其有兩個呈一定角度的七葉β-螺旋槳結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示它和海棗、油棕、小果野蕉的親緣關(guān)系較近。通過5’RACE得到NtWD2、NtWD3基因5’端部分，與已知

4、片段拼接后得到了長為741bp的NtWD2基因片段和長為1639bp的NtWD3基因片段。
　　黃花水仙2號NtWD1、NtWD2、NtWD3、NtWD40基因的表達分析根據(jù)BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）分析，NtWD1基因編碼的蛋白與TPL/TPR類共抑制因子相似度高，而NtWD2、NtWD3和NtWD40基因編碼未注釋功能的蛋白。通過實時熒光定量PCR技術(shù)對上述4個基因進行了組

5、織特異性和七種非生物逆境（干旱、高溫、機械損傷、MeJA、ABA、2,4-D、高鹽）下的表達分析。結(jié)果表明，NtWD40在根中幾乎不表達，NtWD3在根、葉、花瓣、副冠中的表達量基本一致。NtWD1、NtWD2在副冠中的表達量都略高于花瓣。NtWD1基因在MeJA、ABA、2,4-D、高鹽、機械損傷等5組處理中基因表達量都出現(xiàn)了十分顯著的上調(diào)，說明這個基因參與到了上述逆境響應(yīng)中。NtWD2在鹽脅迫處理中表達量變化最為顯著。NtWD3在A