HBV preS-S基因克隆及其在釀酒酵母中表達(dá)研究.pdf

1、乙肝病毒(hepatitis b virus,HBV)為嗜肝病毒,全世界有超過3億人受到乙肝病毒的感染,患上慢性肝炎,進(jìn)而發(fā)展成肝硬化,甚至肝癌.乙肝病毒感染已成為排名第九的世界范圍內(nèi)最常見致死病因.對HBV最新的研究為預(yù)防和治療乙肝起到了巨大的推動(dòng)作用,特別是乙肝病毒疫苗的出現(xiàn).乙肝病毒包括S、P、C和X四段基因,其中S基因編碼的表面抗原HBsAg具有抗原性,已被作乙肝病毒疫苗.目前接種乙肝疫苗后,約有5~10﹪的人無應(yīng)答或低應(yīng)答.乙

2、肝preS基因編碼產(chǎn)物也具有很強(qiáng)的抗原性,可以幫助機(jī)體克服對HBsAg的無應(yīng)答,故可用preS/S基因進(jìn)行表達(dá),制備新的乙肝疫苗,增強(qiáng)免疫效果,提高覆蓋率.該研究利用基因重組技術(shù),將HBV preS/S基因通過酵母附加型載體在釀酒酵母中表達(dá),構(gòu)建了胞內(nèi)表達(dá)HBV preS/S蛋白的基因工程菌.首先設(shè)計(jì)引物利用PCR技術(shù),以HBV病毒DNA為模板體擴(kuò)增出HBV preS/S基因.然后就將PCR擴(kuò)增得到的目的片段連接T載體進(jìn)行測序.將測序結(jié)

3、果進(jìn)行序列分析,與GeneBank中的HBV preS/S基因序列進(jìn)行比較,分析同源性,并確定該基因片段編碼蛋白的血清型.選擇帶有標(biāo)記的表達(dá)載體,將目的基因插入表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn),使其融合于載體中抗原表位標(biāo)記FLAG的下游,可用于目的基因產(chǎn)物的分離和純化.經(jīng)過限制性酶切鑒定后,構(gòu)建得到重組酵母表達(dá)載體.將重組表達(dá)載體pESC-preS/S用LiAc法轉(zhuǎn)化釀酒酵母YPH50,重組載體質(zhì)粒利用2μ復(fù)制子在酵母中自主復(fù)制.在尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型

4、平板SD上篩選陽性重組轉(zhuǎn)化子,通過菌落PCR法進(jìn)行初步鑒定.然后將初步篩選出來的重組子通過提取酵母質(zhì)粒并酶切的方法進(jìn)行鑒定.最終篩選得到含有重組質(zhì)粒pESC-preS/S的酵母轉(zhuǎn)化子.根據(jù)宿主菌和重組菌在不同生長時(shí)期培養(yǎng)液中細(xì)胞密度繪制它們生長曲線圖,分析兩者生長規(guī)律,結(jié)果表明兩者并無太大差別.說明外源基因的導(dǎo)入到宿主酵母的生長無明顯干擾.將重組菌液體培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白,經(jīng)誘導(dǎo)16小時(shí)后離心收集菌體,玻珠法破壁提取蛋白,濃縮后進(jìn)行S