牛肉風味強化肽在釀酒酵母中的克隆和表達.pdf

1、牛肉風味強化肽（BeefyMeatyPeptide，BMP）最初是從牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分離得到的一種八肽。經(jīng)研究分析證明，BMP與食鹽、味精有較好的協(xié)同呈味作用，能增強牛肉風味，并且具有良好的熱穩(wěn)定性，可以滿足食品工業(yè)生產(chǎn)的熱處理要求。因此BMP有潛力成為新一代風味強化劑。本課題在實驗室已構(gòu)建的BMP組成型表達載體pGAP9-16BMP，并在畢赤酵母PichiapastorisGS115(pGAP9-16BMP)中成功表達BMP基

2、礎(chǔ)上，采用基因工程方法在釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中組成型表達BMP，利用釀酒酵母代替畢赤酵母作為宿主菌，以食品級菌株作為宿主菌，保證了表達產(chǎn)物的安全性。
　　以工程菌PichiapastorisGS115（pGAP9-16BMP）基因組DNA為模板PCR擴增PGAP-16BMP，以Scerevisiae基因組為模板PCR擴增終止子CYC1，并將擴增得到的產(chǎn)物克隆于YEp352質(zhì)粒上，構(gòu)建成組成型表

3、達載體YEp352-16BMP。將質(zhì)粒YEp352-16BMP經(jīng)醋酸鋰法轉(zhuǎn)化到S.cerevisiaeW303-1A中，最終通過尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型平板篩選和進一步的PCR驗證，得到能夠分泌表達16BMP的釀酒酵母工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)。
　　優(yōu)化工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件。通過單因素實驗，找出影響作用較大的三個因素為葡萄糖、YP濃度和培養(yǎng)基初始pH值。通過正交試驗選擇出

4、了最佳的搖瓶發(fā)酵條件水平組合:即葡萄糖濃度為3％(w/v)，YP濃度為1.5×，初始pH為5.0。經(jīng)過優(yōu)化后，30℃發(fā)酵48h時，BMP在搖瓶水平獲得最高表達量可達190mg/L。
　　在5L發(fā)酵罐中進行了分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵優(yōu)化釀酒酵母工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)組成型表達BMP。分批發(fā)酵時，發(fā)酵液中BMP在36h時獲得最大表達量為180mg/L。補料分批發(fā)酵時，采用分別在發(fā)酵至12h、15h、18h、21