RaGA基因內(nèi)含子的人工剪接及其在釀酒酵母中的表達研究.pdf

1、當今世界能源短缺和環(huán)境污染已成為限制社會的發(fā)展進步的重要問題，與其它化石燃料相比，乙醇具有可再生、提供清潔的燃燒和不產(chǎn)生溫室氣體等優(yōu)點，乙醇作為替代能源已逐步被人們所認識，成為解決上述問題的有效途徑之一。目前以淀粉為原料高效率發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，主要通過遺傳工程構(gòu)建能夠直接發(fā)酵生淀粉產(chǎn)生乙醇的工程微生物，提高乙醇的產(chǎn)量。葡萄糖淀粉酶是轉(zhuǎn)化淀粉為葡萄糖、果糖糖漿的重要工業(yè)用酶。本研究的目的在于克隆少根根霉葡萄糖淀粉酶基因，并建立酶活檢測體系，為

2、采用shuffling分子進化技術(shù)篩選高活性基因葡萄糖淀粉酶，以及構(gòu)建一步發(fā)酵生淀粉生產(chǎn)乙醇的釀酒酵母工程菌株奠定基礎(chǔ)。
　　 根據(jù)已發(fā)表的米根霉葡萄糖淀粉酶序列，設(shè)計引物從少根根霉葡萄糖淀粉酶基因組中擴增得到根霉葡萄糖淀粉酶基因（含內(nèi)含子）。設(shè)計一系列引物，通過PCR方法在體外將該基因中四個內(nèi)含子剪接除，獲得少根根霉葡萄糖淀粉酶基因編碼序列，克隆到pMD-T載體中獲得中間載體pUC-RaGA，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行擴增并測序。從pU

3、C-RaGA載體上用BamHⅠ限制酶切下1.7kb DNA片段，將其以正確的讀碼框克隆到釀酒酵母整合型表達載體pNK-α-Kan的α因子下游，獲得重組質(zhì)粒pNK-α-Kan，經(jīng)HpaⅠ酶切、線性化后用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化尿嘧啶缺陷型釀酒酵母BJ2407菌株，經(jīng)營缺陷養(yǎng)篩選得到通過同源重組將外源基因插入到其基因組TPI（磷酸丙糖異構(gòu)酶）啟動子的下游的缺陷恢復型轉(zhuǎn)化子NK-RaGA01，培養(yǎng)72小時后，在液體培養(yǎng)基上清液中檢測到葡萄糖淀粉酶活性，表