異源宿主中蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接活性的定向進(jìn)化.pdf

1、蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)是存在于宿主蛋白質(zhì)前體中的一段多肽序列。它能夠催化自身從蛋白質(zhì)前體中剪切下來，同時(shí)將兩側(cè)多肽序列以肽鍵相連。這種翻譯后的加工過程稱為蛋白質(zhì)剪接(protein splicing)。蛋白質(zhì)內(nèi)含子自主催化的剪接反應(yīng)為蛋白質(zhì)的合成和加工提供了新的途徑，因而在蛋白質(zhì)工程及其它領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。但是目前所發(fā)現(xiàn)的天然蛋白質(zhì)內(nèi)含子數(shù)量有限，而且大部分在非天然宿主中的剪接活性顯著降低，因此限制了蛋白質(zhì)內(nèi)含子的開發(fā)和利

2、用；同時(shí)由于對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)與剪接功能之間的關(guān)系仍不十分了解，因此很難通過理性設(shè)計(jì)和改造來提高蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接活性。
　　 本研究以具有極低剪接活性的蛋白質(zhì)內(nèi)含子為實(shí)驗(yàn)材料，利用定向進(jìn)化策略，最終達(dá)到提高其在異源宿主中剪接活性的目的。首先對(duì)來自Trichodesmium erythraeum的DnaB-1、RIR1-3和DnaE-3蛋白質(zhì)內(nèi)含子(TerDnaB-1、Ter DnaE-3、Ter RIR1-3)以及來自Cryp

3、tococcus neoformans AD血清型的PRP8蛋白質(zhì)內(nèi)含子(Cne-AD PRP8)進(jìn)行改造，分別獲得各自的人工型微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子和斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，然后利用麥芽糖結(jié)合蛋白(meltosebinding protein，MBP)和硫氧還蛋白(thioredoxin)組成的檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)各蛋白質(zhì)內(nèi)含子在大腸桿菌中的剪接活性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明Ter DnaE-3和Cne-AD PRP8人工型蛋白質(zhì)內(nèi)含子在大腸桿菌中具有較高的剪接活

4、性，Ter DnaB-1和TerRIR1-3則幾乎沒有剪接活性。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室對(duì)其他蛋白質(zhì)內(nèi)含子的研究結(jié)果，選擇Ter DnaE-1和Ter，DnaE-2人工型微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子(簡(jiǎn)稱為TE1-m和TE2-m)進(jìn)行蛋白質(zhì)剪接活性的定向進(jìn)化研究。定向進(jìn)化策略采用易錯(cuò)PCR(error prone PCR)構(gòu)建相應(yīng)的突變庫(kù)，然后利用依賴卡那霉素抗性所建立的蛋白質(zhì)剪接篩選系統(tǒng)進(jìn)行快速有效的篩選，即將TE1-m和TE2-m的編碼序列插入卡那霉素抗性

5、基因中，造成卡那霉素抗性基因編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶(phosphotransferase)失活。蛋白質(zhì)內(nèi)含子經(jīng)過進(jìn)化后發(fā)生剪接，磷酸轉(zhuǎn)移酶恢復(fù)原始的結(jié)構(gòu)和活性，從而能夠在含有一定濃度卡那霉素的平板上生長(zhǎng)。本研究共進(jìn)行三輪篩選：第一輪在卡那霉素濃度為5μg/ml的平板上篩選，共獲得20個(gè)陽(yáng)性突變體；第二輪在卡那霉素濃度為10μg/ml的平板上篩選，共獲得11個(gè)陽(yáng)性突變體；第三輪在卡那霉素濃度為20μg/ml的平板上篩選，沒有獲得陽(yáng)性突變體。所獲

6、得的突變體均利用Western印跡對(duì)其蛋白質(zhì)剪接活性進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過兩輪易錯(cuò)PCR，有效突變積累后，獲得一個(gè)剪接活性明顯提高的突變體pK⊿TE2-⊿G。該突變體中有三處突變，其中兩處分別是TE2-m的第52位氨基酸(由Ile變?yōu)镻he，I52F)和第100位氨基酸(由Pro變?yōu)镾er，P100S)；第三處是載體上-1位氨基酸，即與TE2-m的N端相連的第一個(gè)氨基酸，由Ala變?yōu)镚ly(A-1G)。進(jìn)一步的研究表明這三處突變共同