N端無半胱氨酸斷裂蛋白質內含子的構建及蛋白質N端標記的應用.pdf

1、蛋白質是細胞功能的主要執(zhí)行者。在許多情況下，一個細胞功能的實現是多個蛋白質分子相互作用的結果。近年來，隨著蛋白質標記技術的不斷發(fā)展與成熟，對蛋白質的研究進入了一個高速發(fā)展的階段。對它們的研究主要包括“體內”和“體外”兩個方向。體外研究的重點是純化后的蛋白質，將它們置于可控制的環(huán)境中，以期獲得它們的功能信息；而體內研究實驗著重于蛋白質在細胞或者整個組織中的活性作用，從而可以了解蛋白質發(fā)揮功能的場所和相應的調節(jié)機制。
　　 在體內或

2、者體外的蛋白質工程和蛋白質修飾有利于幫助探究蛋白質的生物功能和結構功能。目前對蛋白質進行標記的方法主要有各種化學方法和利用蛋白質內含子的反式剪接進行的標記。前者大多數相對簡單易行，可是存在許多不足之處，如特異性不強，化學標簽容易干擾被標記蛋白的活性，蛋白濃度要求較高等；后者是一項新興的蛋白質標記技術，它雖然克服了化學標記的不足可是目前仍有融合蛋白不穩(wěn)定、溶解性較差、活性低和通用性差等急需解決的問題。本文在蛋白質反式剪接的基礎上另辟蹊徑，

3、尋找內部半胱氨酸較少的內含子，對活性較高的內含子我們利用定點突變、搭橋PCR等方法，構建斷裂蛋白質內含子，獲得活性較高的N末端(整個intein內部)無半胱氨酸的內含子，并通過SDS-PAGE，Western Blot等方法檢測蛋白質內含子的剪接活性，然后利用實驗室的TM系統(tǒng)檢測蛋白質內含子作為標記手段的應用潛質。最后選擇合適的蛋白進行N端特異性標記。
　　 本課題選取蛋白質內含子TerNdse-2、TX-S1、HaVol Po

4、l、Msm DnaB-1、Arsp FB24和PP-PhiEL ORF40進行蛋白質N端標記的研究。其中Msm DnaB和Arsp FB24為3型蛋白質內含子，其余均為常見的1型蛋白質內含子。TerNdse、TX-S1(C1/S)、HaVol Pol、Msm DnaB-1和Arsp FB24的一位氨基酸分別為絲氨酸、絲氨酸、丙氨酸和甘氨酸，這些intein內部半胱氨酸也非常少，有利于定點突變和后續(xù)標記的應用。
　　 首先對這些蛋

5、白質內含子的原始剪接活性進行檢測，在體內pMTerNdse-2有微弱接活性，pMTX-S1(C1/S)有較高的剪接活性(本實驗室已研究，體內和體外均由較高的剪接活性)，pMHP的剪接活性為100％，pMMD(C1突變成S后)有微弱的剪接活性，pMAF沒有任何剪接活性。
　　 接著對pMTerNdse-2、pMTX-S1(C1/S)和pMHP進行氨基酸定點突變，將其內部的所有半胱氨酸通過搭橋PCR突變成絲氨酸，同時將pMMD內部的

6、C1恢復。通過Western Blot檢測它們的剪接活性。pMTerNdse-2、pMTX-S1(C1/S)和pMHP在半胱氨酸完全突變后沒有任何剪接活性，pMMD有非常高的剪接活性。
　　 對pMHP，將其內部的四個半胱氨酸分別突變成絲氨酸，我們發(fā)現第二個半胱氨酸可以決定其剪接活性，利用定點突變的方法選擇其側鏈基團相似的氨基酸進行替換，首先選擇蘇氨酸和甘氨酸進行替換，幸運的獲得了兩個內部有剪接活性的無半胱氨酸的HP突變體、pM

7、HPG和pMHPT，為獲得一種通用性的標記intein奠定了基礎。
　　 通過和實驗室的蛋白質內含子進行比對等確定S1、S0和S11三個斷裂位點，構建pMTerNdse-2、pMMD、pMHP、pMHPG和pMHPT對應的S1、S0和S11體內斷裂蛋白質內含子。通過Western Blot檢測其剪接活性，pMTerNdse-2、pMHP和pMHPG三個斷裂intein沒有剪接活性，pMHPT-S1有較高的剪接活性；pMMD-S0

8、有100%的剪接活性。
　　 通過SWISS MODLE建模，Protean比對等，從新選擇了其它斷裂位點，pMHP、pMHPG和pMHPT選擇了10個新的斷裂位點F1-F10，pMMD重新選擇了5個斷裂位點F1-F5。通過Western Blot檢測其體內剪接活性，結果顯示，pMHP-F2和F8有較高的剪接活性；pMHPT只有F2有剪接活性；pMMD只有F4有非常高的剪接活性。
　　 選擇pMHP-F2、pMHP-F8

9、、pMHPT-S1、pMHPT-F2、pMMD-SO、pMMD-F4和pMTX-S1(C1/S)幾個蛋白質內含子，構建含有N端前體蛋白或C端前體蛋白相應序列的表達質粒，麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein，MBP)與IN組成的融合蛋白為N端前體蛋白；Ic與硫氧還蛋白(thioredoxin，T)組成的融合蛋白為C端前體蛋白。利用N端前體蛋白帶有的MBP標簽可以與Amylose resin特異性結合，C端前體蛋白

10、帶有的6×組氨酸標簽可以與Ni-NTA resin特異性結合，純化得到用于后續(xù)體外反應所需的N端前體蛋白和C端前體蛋白。
　　 將純化的N端前體蛋白與C端前體蛋白在摩爾比為1:1的條件下進行反應，通過Western印跡檢測剪接反應的活性，結果表明，斷裂蛋白質內含子pMTX-S1(C1/S)和pMMD-S0有部分剪接活性，其余蛋白質內含子的體外剪接活性還需要進一步實驗驗證。
　　 對有剪接活性的體外斷裂蛋白質內含子，我們選

11、擇TXS1在TM系統(tǒng)檢測其蛋白質N端標記的應用。將TX-SIN構建到含有SUMO的PEDHC表達載體中，體外純化TX-S1N和TX-S1C蛋白，TX-S1N與巰基染料以1:5的比例反應4小時，通過透析袋透析掉未反應的染料，接著SUMO酶與L-X-S1N反應1小時，切除SUMO蛋白，將L-TX-S1和TX-S1C在體外剪接Buffer內反應3小時，SDS-PAGE檢測，利用波長346-442納米的紫外觀察拍照。
　　 本課題不僅是

12、對前人研究的補充，同時還克服了化學合成和蛋白質標記的不足之處，實現了蛋白質的N-端特異性位點標記。為實現可控的、特異的、對目標蛋白影響小的對目標蛋白的標記及實際應用奠定了基礎。同時，我們發(fā)現了一種非常有意思的現象：pMHP和pMMD內部一個非保守區(qū)的半胱氨酸竟然可以決定蛋白質內含子的活性，目前沒有相關文獻的報道，其化學和分子生物學機理值得繼續(xù)研究，相信是蛋白質內含子剪接理論知識的很好補充。另外，獲得了兩個活性非常高的內部無半胱氨酸的蛋白