水稻基因AL2調(diào)控葉綠體內(nèi)含子剪接的分子機(jī)理研究.pdf

1、葉綠體通過光合作用合成植物激素和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物，對植物正常的生長和發(fā)育過程起著重要的作用。葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、葉綠素的含量與植物的光合作用及其生長發(fā)育密切相關(guān)。葉綠體發(fā)育的缺陷通常會導(dǎo)致植物葉色的變異，因而葉色突變體是研究植物葉綠體發(fā)育和光合作用的理想材料。盡管一些參與葉綠體分化和發(fā)育的基因或調(diào)控基因已經(jīng)被分離和鑒定，但是葉綠體分化和發(fā)育的分子機(jī)理仍有待于進(jìn)一步研究，新基因的鑒定和功能分析對于深入了解葉綠體分化和發(fā)育仍十分重要。
　　

2、本實驗室前期通過對T-DNA插入突變體庫（粳稻中花11背景）進(jìn)行表型篩選，得到了一系列的白化苗突變體，稱之為albino leafmutants（als）。本實驗室已對albino leaf1（al1）進(jìn)行了詳細(xì)的鑒定和分析。因此，本研究著重對突變體albino leaf2（al2）開展相關(guān)的研究。獲得了以下結(jié)果：
　　1、表型分析表明，突變體al2在萌發(fā)出芽后即表現(xiàn)出明顯的白化表型，整個植株全白，生長至三葉期幼苗死亡；葉綠素含量

3、測定結(jié)果表明，突變體al2的葉綠素含量幾乎為零，顯著低于野生型中花11（ZH11）。
　　2、透射電鏡觀察結(jié)果表明，在早期的發(fā)育階段，突變體al2葉片的葉綠體結(jié)構(gòu)即存在著嚴(yán)重的缺陷，無法形成完整的類囊體結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致葉綠體整體的降解。
　　3、實驗室前期工作已證實T-DNA插入基因Loc_Os09g19850的第9個外顯子導(dǎo)致了突變體al2出現(xiàn)白化表型。RT-PCR的結(jié)果表明，由于T-DNA的插入導(dǎo)致了基因Loc_Os09g

4、19850不表達(dá)，初步證實了al2的突變表型受Loc_Os09g19850基因所控制，即Loc_Os09g19850就是水稻基因AL2（Albino Leaf2）的候選基因。水稻基因AL2具有9個外顯子和8個內(nèi)含子，編碼了一個葉綠體內(nèi) IIA型內(nèi)含子剪接因子 CRS1（chloroplast group IIA intron splicing facilitator）。
　　4、功能驗證結(jié)果進(jìn)一步證實Loc_Os09g19850就

5、是水稻基因AL2。獲得5個獨立的Loc_Os09g19850互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)表型觀察、葉綠素含量測定和qRT-PCR等證實基因 Loc_Os09g19850的表達(dá)可恢復(fù)突變體 al2的表型；獲得了6個獨立的Loc_Os09g19850反義轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)表型觀察和 qRT-PCR等證實基因Loc_Os09g19850的功能喪失可重現(xiàn)突變體al2的表型。
　　5、AL2啟動子與GUS基因融合表達(dá)的結(jié)果表明，AL2從種子萌動起就開始表

6、達(dá)，一直到成熟期；幼苗階段除在幼葉等綠色組織表達(dá)外，也在胚根鞘和根毛等非綠色組織表達(dá)；在成熟葉中表達(dá)最強(qiáng)，在穗、穎花、莖和葉鞘等均表達(dá)；組織切片顯示，AL2在莖的內(nèi)皮層也表達(dá)。qRT-PCR的結(jié)果也表明AL2在根、莖、葉、幼穗和成熟穗中均表達(dá)，其中在葉中表達(dá)最強(qiáng)。另外，亞細(xì)胞定位結(jié)果表明AL2蛋白定位于葉綠體。
　　6、已有的報道證實CRS1在擬南芥和玉米中調(diào)控了葉綠體atpF基因的IIA型內(nèi)含子的剪切。本研究發(fā)現(xiàn)，atpF基因在

7、突變體al2中的表達(dá)顯著低于其在野生型的表達(dá)，暗示AL2基因在水稻中亦編碼了一個有功能的CRS1。同時，對葉綠體內(nèi)含有IIB型內(nèi)含子的ndhA、ndhB、petD和ycf3等基因和含有I型內(nèi)含子的trnL基因的qRT-PCR結(jié)果表明，AL2極有可能參與了水稻葉綠體內(nèi)含有IIB型和I型內(nèi)含子的基因的剪接調(diào)控。
　　7、對突變體al2中葉綠體相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了qRT-PCR分析，結(jié)果表明：AL2基因的功能喪失顯著下調(diào)了OsHAP3A

8、、OsHAP3B、OsHAP3C、OsPPR1、YGL1、Cab1R、Cab、HemA和Cao等葉綠素生物合成相關(guān)基因（chlorophyll biosynthetic genes，CBGs）以及psbO、psaD、psaE、psbP、lhcb2和rbcS等核編碼的葉綠體基因（nuclear-encoded chloroplast genes，NECGs）的表達(dá)；同時還下調(diào)了psaA和psbA兩個質(zhì)體編碼的多聚酶（plastid-enc

9、oded polymerase，PEP）的表達(dá)，但對psaB和rps14兩個PEP以及atpA、petA、rpoB和rps2等核編碼的多聚酶（nucleus-encoded polymerase，NEP）的表達(dá)無作用。因此，AL2是通過協(xié)同部分葉綠體相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控水稻葉綠體發(fā)育。
　　總之，本研究鑒定了一個與水稻葉綠體發(fā)育相關(guān)的基因AL2，該基因的功能喪失導(dǎo)致了突變體 al2的白化表型；分子克隆和功能分析證實 Loc_Os0