桃褐腐病菌Cyt b基因1166bp內(nèi)含子對G143A突變影響的分子機理初步研究.pdf

1、由鏈核盤菌(Monilina spp)引起的桃褐腐病是世界范圍內(nèi)桃園里的重要病害之一，而美澳型核果鏈核盤菌(M.fructicola)在我國許多桃產(chǎn)區(qū)均能采集得到，是我國的優(yōu)勢菌種。國內(nèi)外用于防治該病主要采用苯丙咪唑類、麥角甾醇合成抑制劑和甲氧基丙烯酸酯類呼吸抑制劑這三大類殺菌劑。目前已經(jīng)在田間發(fā)現(xiàn)了對前兩類殺菌劑的抗性菌株，而呼吸抑制劑類抗性菌株尚未發(fā)現(xiàn)。通過克隆呼吸抑制劑類殺菌劑靶標(biāo)基因Cyt b序列得知，在突變發(fā)生熱點G413的編

2、碼序列GGT后存在一個1166bp內(nèi)含子，是否由于該內(nèi)含子的存在影響了G143A突變的發(fā)生而不能產(chǎn)生抗藥性，本文就這個問題進行了初步探索。
　　 本文采用三種方法來探索該分子機理。首先是同源置換，采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化進行兩次敲除，將含有G143A突變引入到Cyt b基因中，檢測該基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。其次是插入突變，建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的孢子轉(zhuǎn)化體系，將含有G143A突變的Cyt b基因插入到核基因組中，檢測該基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。最

3、后是酵母異源表達，采用成熟的酵母表達體系，在酵母DNA中引入M.fructicola的Cyt b cDNA和G143編碼基因后的內(nèi)含子，檢測該內(nèi)含子正常剪切和G143A突變之間是否互相影響。
　　 本文首先研究了PEG介導(dǎo)的M.fructicola原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系，20μg/ml潮霉素濃度為對應(yīng)菌株的最小抑制濃度(MIC)值。經(jīng)優(yōu)化得到了原生質(zhì)體最佳制備條件：采用CM液體培養(yǎng)基+玻璃珠搖培3天，收集菌絲。用1.5mg/ml蝸

4、牛酶(Snailase)和10 mg/ml溶菌酶(Lysozyme)的酶組合酶解3h，能得到高質(zhì)量的原生質(zhì)體。
　　 在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的M.fructicola孢子遺傳轉(zhuǎn)化實驗中，確認了M.fructicola孢子平均含有3-4個細胞核，并初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的M.fructicola孢子遺傳轉(zhuǎn)化體系。
　　 利用酵母表達體系，成功構(gòu)建酵母表達質(zhì)粒，將含有G143A突變的Cyt b基因連同1166 bp的內(nèi)含子轉(zhuǎn)入酵母細胞D