第三內(nèi)含子+11G＞ASNP對(duì)hURAT1基因轉(zhuǎn)錄的影響.pdf

1、目的:hURAT1是維持血尿酸水平的關(guān)鍵離子通道，是導(dǎo)致原發(fā)性高尿酸血癥的重要侯選基因。根據(jù)前期工作基礎(chǔ)，第三內(nèi)含子+11 G>A SNP與原發(fā)性高尿酸血癥遺傳易感性密切相關(guān)。本研究擬進(jìn)一步開展體外功能研究，探討該點(diǎn)SNP是否通過影響hURAT1基因mRNA的可變剪接而改變hURAT1蛋白結(jié)構(gòu)，近而增強(qiáng)腎近端小管對(duì)尿酸的重吸收，導(dǎo)致腎臟對(duì)尿酸的排泄減少以及高尿酸血癥。 方法:提取正常人全血基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增第2外顯子至

2、第5內(nèi)含子之間的全基因組序列片段，將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體pcDNA3.1（-）連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。野生型重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和EcoR I酶切后，應(yīng)用核苷酸序列測(cè)定方法進(jìn)行鑒定。應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)改變上述野生型pcDNA3.1（-）-hURAT1重組質(zhì)粒第三內(nèi)含子+11 G→A，構(gòu)建突變型pcDNA3.1（-）-hURAT1重組質(zhì)粒。將野生型和突變型質(zhì)粒設(shè)立為兩組試驗(yàn)組，并分別設(shè)立陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

3、使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞及細(xì)胞裂解液的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以hURAT1基因的cDNA為模板，根據(jù)所插入片段設(shè)計(jì)5’和3’端寡核酸引物，分別擴(kuò)增各組mRNA序列。1％瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)物片段，割膠純化目的條帶，核苷酸序列鑒定。 結(jié)果:1.野生型pcDNA3.1（-）-hURAT1重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序顯示hURAT1片段插入序列和方向正確，符合pcDNA3.1（-）載體的讀碼框架，證明目的基因已成功轉(zhuǎn)入pcDNA

4、3.1（-）載體中。2.突變型pcDNA3.1（-）-hURAT1重組質(zhì)粒經(jīng)過定點(diǎn)突變改變后測(cè)序鑒定，hURAT1基因第三內(nèi)含子+11已發(fā)生G→A點(diǎn)突變，其它序列與野生型hURAT1重組質(zhì)粒的序列和方向均完全一致，并且符合pcDNA3.1(-)載體的讀碼框架，證明突變重組體己構(gòu)建成功。3.各細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增凝膠電泳，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染野生型pcDNA3.1-hURAT1組出現(xiàn)了一條特異性的條帶，轉(zhuǎn)染突變型pcDNA3.1-hUR

5、AT1組出現(xiàn)了兩條特異性的條帶，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組無特異性的條帶。割膠純化所出現(xiàn)的目的條帶，進(jìn)行測(cè)序并與GeneBank中的序列比對(duì)，結(jié)果顯示突變型的其中一條條帶發(fā)生了可變剪接改變，第五外顯子的編碼序列完全缺失，另一條與野生型序列一致。 結(jié)論:hURAT1基因第三內(nèi)含子+11G>A SNP體外功能研究證實(shí)該點(diǎn)SNP影響hURAT1 mRNA可變剪接過程，第五外顯子編碼基因完全缺失，產(chǎn)生hURAT1剪接異構(gòu)體，從而增加腎臟對(duì)尿