二球懸鈴木AG基因第二內(nèi)含子的克隆與功能研究.pdf

1、二球懸鈴木(Platanus acerifolia Willd)是一種被人們廣泛栽培的行道樹種，它有很多優(yōu)點，如栽培容易、生長迅速、樹形挺俊、冠大蔭濃、抗病蟲害等。但是，二球懸鈴木在每年春末夏初之時，大量花粉隨風(fēng)飛灑，同時隔年的種球散開脫落，造成“飄粉飛毛”現(xiàn)象，嚴(yán)重影響人們的工作生活，很大程度上限制了推廣應(yīng)用。
　　本研究通過分析懸鈴木AGAMOUS(AG)基因第二內(nèi)含子的表達(dá)特性，進(jìn)而驅(qū)動細(xì)胞毒素基因培育不育轉(zhuǎn)基因植株的策略，

2、來解決懸鈴木花粉和種毛污染問題。我們先通過TAIL-PCR的方法分離得到二球懸鈴木AG基因第二內(nèi)含子，然后用內(nèi)含子驅(qū)動GUS基因和毒性基因構(gòu)建融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草與擬南芥對內(nèi)含子的表達(dá)特性和功能進(jìn)行分析鑒定，主要研究成果如下:
　　1.AG基因第二內(nèi)含子具有調(diào)控AG基因特異表達(dá)的特性，因此克隆了二球懸鈴木
　　AG同源基因PlacAG基因4644bp第二內(nèi)含子的序列，命名為PlacAGI，利用生物信息學(xué)的方法對PlacAG

3、I序列的調(diào)控元件做了初步的預(yù)測分析，分析結(jié)果證明PlacAGI包含了大量的組織特異調(diào)控元件。
　　2.構(gòu)建了fPlacAGI∷GUS，rPlacAGI∷GUS，fPlacAGI-mi35S∷GUS，rPlacAGI-mi35S∷GUS融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化了煙草與擬南芥，通過對轉(zhuǎn)基因植株的組織進(jìn)行GUS染色檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)GUS表達(dá)基因的煙草和擬南芥的雌蕊和雄蕊中GUS特異表達(dá)，在其它部位GUS基因未表達(dá)。這表明PlacAGI具有嚴(yán)

4、格的組織特異性，能夠調(diào)控連接在其下游的基因在花的第三、四輪器官特異表達(dá)。
　　3.構(gòu)建了不育植物表達(dá)載體fPlacAGI∷Barnase-mi35S-Barstar，rPlacAGI∷Barnase-mi35S-Barstar,fPlacAGImi35S∷Barnase-mi35S-Barstar,rPlacAGImi35S∷Barnase-mi35S-Barstar并轉(zhuǎn)化煙草，得到四種載體的轉(zhuǎn)基因陽性植株，通過對陽性植株的表型觀

5、察與分析，結(jié)果表明，AG基因第二內(nèi)含子能夠特異的調(diào)控連接在其下游的Barnase基因特異的表達(dá)于轉(zhuǎn)基因煙草的雄蕊和心皮，導(dǎo)致這兩輪花器官消融。同時，轉(zhuǎn)化煙草出現(xiàn)強(qiáng)表型和弱表型之分，強(qiáng)表型植株花的第二、三、四輪花器官均消融，花直接早落;弱表型植株僅第三、四輪花器官消亡。同時還發(fā)現(xiàn)懸鈴木AG基因第二內(nèi)含子正向與反向插入載體對其功能的行使有影響，正向插入時轉(zhuǎn)基因煙草的表型更為明顯。還發(fā)現(xiàn)PlacAGI具有微弱的啟動子功能，在其下游沒有連接60