水稻粒寬基因GS5的調控與分子機理研究.pdf

1、水稻是最重要的糧食作物之一，如何提高水稻產量一直是科學研究與育種研究長期關注的重點。水稻產量由單位面積穗數、每穗實粒數和千粒重三個因素構成，千粒重由穎殼的體積和胚乳發(fā)育狀況兩個因素決定，對穎殼形狀與體積的描述一般稱為粒形，包括粒長、粒寬和粒厚，因此，粒形是重要的產量性狀之一。前人通過圖位克隆法分離到GS5，它是第五染色體上的一個正調控粒寬、粒重和灌漿速率的微效基因，窄粒等位基因GS5-H94與寬粒等位基因GS5-ZS97之間的差異主要是

2、啟動子區(qū)存在的18個多態(tài)性位點造成兩者表達水平的高低不同。提高GS5的表達量可以增加粒寬，因為GS5影響了一系列細胞周期調控基因的表達，GS5表達量的提高可以促進穎殼細胞分裂，增加穎殼細胞數目。本研究主要內容包括：
　　⑴GS5在綠色組織中的表達水平遠高于非綠色組織，在非綠色組織中表達量最高的是發(fā)育中的幼穗。在幼穗發(fā)育過程中寬粒等位基因GS5-ZS97的表達量高于窄粒等位基因GS5-H94，而在綠色組織中GS5-H94的表達量反而

3、更高，暗示GS5的表達受到至少兩種不同因素的調控。
　?、艷S5啟動子的順式作用元件大部分是光響應元件，兩個等位基因的多態(tài)性位點主要造成光響應元件的數量不同，GS5-H94含有更多的光響應元件。研究證實GS5的表達受光照誘導，并在一天中表現出節(jié)律性變化。GS5-H94受光照誘導后表達量的改變更為劇烈，因此，可以解釋GS5在綠色組織中高表達，且GS5-H94拘表達量高于GS5-ZS97。
　　⑶利用一系列截短與定點誘變的啟動子

4、-GUS(β-Glucuronidase)片段分析造成幼穗中表達量差異的關鍵位點，發(fā)現啟動子-1139 bp至-931 bp（記為B區(qū)）對GS5的差異表達具有最關鍵的影響。比較GS5-H94、GS5-ZS97與來自寬粒品種中花11的第三種單倍型GS5-ZH11的啟動子-1139 bp至-604 bp區(qū)段（B、C區(qū)），鑒定出GS5-H94特有的三個SNPs（SNP_-1109，SNP_-1032和SNP-825），將GS5-ZS97的SN

5、P_-1109和SNP_-1032誘變?yōu)镚S5-H94基因型可將其啟動子強度降低到GS5-H94水平上。
　?、葐幼覤區(qū)的SNP-1109和SNP-1032位于一個GA(Gibberellin)響應元件側翼，C區(qū)的SNP-825造成兩個等位基因產生一個光響應元件的差異。將GA響應元件誘變缺失后，啟動子強度上升，表明GA響應元件的作用是抑制表達;將光響應元件誘變后，啟動子強度下降，表明光響應元件的作用是促進表達;在幼穗中，GA響應

6、元件對啟動子強度的影響更大。激素處理結果表明GS5的表達不受GA影響，但ABA(Abscisic Acid)對GS5-H94的表達有明顯的抑制作用，對GS5-ZS97的影響則不明顯，從而造成GS5-H94的表達量低于GS5-ZS97。
　?、蒅S5是一種絲氨酸羧肽酶類蛋白，GS5-H94和GS5-ZS97的蛋白質功能沒有差異，表達量的提高都可以使粒寬增加。GS5是分泌性蛋白質，定位于細胞表面，與細胞膜之間存在密切聯系。過量表達時有

7、相當一部分GS5蛋白滯留在內質網中。
　?、式湍鸽p雜交篩選到GS5可與細胞膜蛋白OsBAK1-7（擬南芥BAK1(BRI1-Associatied Kinase1)的同源基因）的胞外LRR(Leucine-Rich Repeat)結構域互作。如同擬南芥的報道，OsBAK1-7的LRR結構域也可與OsMSBP1（擬南芥MSBP1(Membrane Steroid-Binding Protein1)的同源基因）互作，這種互作會促進Os

8、BAK1-7的內吞。本研究表明當細胞表面存在大量的GS5蛋白時，GS5與OsBAK1-7的互作會競爭性抑制后者與OsMSBP1的互作，從而阻止OsBAK1-7的內吞。這種競爭性互作可以在一定程度上解釋為什么GS5的表達水平與表型正相關。
　?、薌S5的表達受到BR(Brassinosteroids)的抑制;擬南芥BR信號轉導途徑中的一個絲氨酸羧肽酶BRS1在水稻中的超表達也可使粒寬增加，且粒寬也與其表達水平正相關;加上GS5與Os

9、BAK1-7的互作關系，暗示GS5很可能通過BR信號轉導途徑調控穎殼細胞分裂和粒寬。OsBAK1-7超表達后植株半矮，莖稈變細，缺失突變體株高增加，莖稈變粗，可能對水稻生長具有一定的抑制作用，但粒形沒有變化;OsMSBP1在各個組織時期都有很高的表達，其缺失突變體成苗率極低，絕大部分在萌發(fā)后死亡，植株矮化、分蘗減少、粒形變小，表明它對水稻生長有必不可缺的作用。這兩個基因在BR信號轉導中的作用還需進一步研究，目前的初步結果認為它們對水稻生

10、長的作用是相反的，GS5通過對它們互作平衡的調節(jié)實現對表型的控制。
　　⑻對527份核心種質材料和17份野生稻材料進行GS5的比較測序，從ATG上游2 kb到3'-UTR共6.4 kb的區(qū)間內鑒定出130個SNPs和27個InDels，其中70％以上的多態(tài)性位點分布在2 kb的啟動子區(qū)。根據這些多態(tài)性位點可將GS5分成49個單倍型(Haplotype)，歸為12個單倍群(Haplogroup)。一共鑒定出10種完整形式的GS5蛋白

11、類型，它們之間只有少數氨基酸的差異，沒有發(fā)現提前終止的類型，其中GS5-P2（即GS5-H94）是最古老的蛋白質類型，GS5-P1（即GS5-ZS97）形成較晚。
　　⑼四大單倍群中，GS5-1型（即GS5-ZS97型）和GS5-2型（即GS5-H94型）主要分布在秈稻中，GS5-3型（即GS5-ZH11型）主要分布在粳稻中，GS5-4型主要分布在aus稻中。由于群體結構的存在，只能比較秈稻中GS5-1型和GS5-2型材料的粒形差

12、異，為了剔除同一染色體上粒寬主效基因qSW5/GW5的效應影響，對其基因型進行鑒定。結果發(fā)現相同qSWS/GW5基因型的材料中GS5-1型和GS5-2型材料的粒寬沒有顯著差異，表明GS5的微弱效應在自然群體中被掩蓋了。
　?、卧诙i稻IndI亞群中檢測到GS5的Tajima's D值顯著小于0，π值非常低，且該亞群中絕大部分是GS5-1型材料，暗示形成較晚的GS5-1可能受到人工選擇，但其微弱的效應似乎不太可能被人類發(fā)現和選擇。分析