水稻鉻毒害和耐性的生理與分子機(jī)理研究.pdf

1、土壤鉻污染已對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類(lèi)健康造成了嚴(yán)重的威脅。環(huán)境中的鉻主要以Cr3+和Cr6+兩種氧化形態(tài)存在。雖然Cr3+是人類(lèi)和動(dòng)物必需的營(yíng)養(yǎng)元素，但Cr3+和Cr6+對(duì)植物都具有嚴(yán)重的毒害作用，且Cr6+的毒性遠(yuǎn)強(qiáng)于Cr3+。與鎘、鉛、鋁等重金屬相比，鉻的電子化學(xué)結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，在自然條件下Cr3+與Cr6+極易通過(guò)氧化還原反應(yīng)發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，這些特性使鉻毒害和耐性研究相對(duì)遲緩。迄今，鉻在植物生長(zhǎng)發(fā)育和生理代謝上的毒害作用雖已有一定的了解，但有

2、關(guān)鉻毒害和耐性的機(jī)理尚缺乏深入研究。本研究以鉻耐性與積累差異顯著的水稻基因型(秀水113和單KS)為材料，從鉻的環(huán)境化學(xué)、鉻的毒害效應(yīng)、水稻對(duì)鉻的吸收和積累、鉻在水稻組織的亞細(xì)胞分布以及水稻鉻脅迫響應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)等方面系統(tǒng)地研究了水稻鉻耐性的生理和分子機(jī)理，并探索了緩解鉻毒害的化學(xué)調(diào)控途徑。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.土壤pH值和有機(jī)質(zhì)含量對(duì)土壤重金屬有效態(tài)以及水稻籽粒中重金屬含量的影響
　　 植物對(duì)重金屬的吸收一方面

3、與植物的遺傳和生理特性有關(guān)，另一方面主要受土壤中重金屬遷移性和有效性的影響，而它們則由土壤的各種理化特性決定。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定Cr、Cu、Fe、Mn、Pb和Zn等重金屬在不同土壤中的有效態(tài)含量和水稻植株與籽粒中的濃度，研究了土壤pH值和有機(jī)質(zhì)含量對(duì)稻田重金屬有效性和水稻吸收重金屬的影響。結(jié)果顯示，土壤中有效態(tài)重金屬含量與土壤pH值呈顯著負(fù)相關(guān)，而與有機(jī)質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)。多元回歸分析表明，土壤pH和有機(jī)質(zhì)含量對(duì)Cu、Pb和Zn的有效性變化

4、均有顯著影響，而Cr、Fe的有效性主要受有機(jī)質(zhì)含量的影響，Mn的有效性受土壤pn的影響較大。結(jié)果還顯示，土壤中有效態(tài)重金屬含量高的試驗(yàn)點(diǎn)水稻植株重金屬含量相對(duì)較高，說(shuō)明土壤重金屬的有效性影響著水稻對(duì)重金屬的吸收和積累。相關(guān)分析表明，水稻植株和籽粒中重金屬的含量與土壤pH值呈負(fù)相關(guān)，而與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)。多元回歸分析結(jié)果揭示，土壤pH值是影響水稻植株中重金屬含量的重要因素。由此推測(cè)，大田生產(chǎn)上通過(guò)相關(guān)農(nóng)藝措施調(diào)節(jié)土壤的酸堿度，可有效

5、降低稻米的重金屬含量。
　　 2.水稻籽粒中鉻、鎘、鉛含量的基因型和環(huán)境差異
　　 重金屬的吸收和積累在不同作物種類(lèi)之間以及同一作物不同基因型之間存在著顯著差異，選育或培育具有重金屬低積累特性的作物品種是降低重金屬污染地區(qū)作物產(chǎn)品重金屬含量的有效途徑。在低積累重金屬作物品種的篩選上，有效地評(píng)估和鑒定食用器官的重金屬含量是關(guān)鍵技術(shù)。本試驗(yàn)以138份水稻品種(品系)為材料，分析了它們種植在不同污染程度土壤中的植株和籽粒重金屬

6、含量。結(jié)果顯示，水稻籽粒Cr、Cd和Pb含量隨土壤污染程度的加重而增加，同時(shí)不同基因型之間存在著顯著的差異。在三種污染程度下，138份水稻材料的籽粒Cr濃度最大值/最小值比均達(dá)20倍以上，基因型間的變異系數(shù)超過(guò)55％。水稻基因型與環(huán)境(污染程度)對(duì)籽粒中Cr、Cd以及Pb含量有顯著的互作效應(yīng)。本研究篩選到一批籽粒Cr、Cd、Pb含量在三種污染程度下始終保持高水平或低水平的水稻品種(品系)，如HG-5、單K5和湖優(yōu)-1的籽粒在三種污染程度

7、下均具有高Cr含量；而秀水113、秀水09和明珠1號(hào)的籽粒則具有低Cr含量；秀水11、嘉02-5和明珠1號(hào)為籽粒高鎘積累材料，而春江026、春江11和湖97-98為籽粒低鎘積累材料；單K5、單K8、嘉單繁18為籽粒高鉛積累材料，而嘉02-5、嘉C1和單K15為籽粒低鉛積累材料。
　　 3.鉻脅迫對(duì)水稻抗氧化系統(tǒng)和養(yǎng)分吸收積累的影響
　　 本試驗(yàn)以?xún)蓚€(gè)前期篩選出的籽粒鉻積累特性不同的水稻品種(秀水113和單K5)為材料，分

8、析了鉻脅迫對(duì)水稻抗氧化系統(tǒng)和養(yǎng)分吸收積累的影響。低水平鉻處理(10μM Cr)對(duì)MDA含量影響不大，但增加SOD和POD的活性。在高鉻水平(100μM)下，水稻葉片和根系的MDA含量顯著增加，SOD和POD活性則顯著降低，說(shuō)明高水平鉻處理對(duì)水稻幼苗造成了嚴(yán)重的氧化脅迫。另外，高濃度鉻處理顯著降低水稻根、莖、葉、籽粒中營(yíng)養(yǎng)元素的含量，說(shuō)明鉻脅迫干擾植物養(yǎng)分的吸收和分配。水稻單株養(yǎng)分積累量在10μM Cr處理下最高，在100μM Cr處理下

9、最低，其原因與鉻脅迫造成水稻植株生長(zhǎng)受阻和根細(xì)胞損傷有關(guān)。鉻對(duì)養(yǎng)分積累的影響因基因型而異，鉻脅迫下單K5中N、P、K、Ca、Zn的單株積累量均顯著高于秀水113。
　　 4.鉻脅迫對(duì)水稻根際pH值變化和有機(jī)酸分泌的影響
　　 本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定水稻培養(yǎng)液的pH值和檢測(cè)水稻根系分泌的有機(jī)酸含量，研究了不同鉻處理水平下根際pH值和有機(jī)酸分泌的變化。結(jié)果表明，水稻根際的pH值隨鉻處理濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著升高。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)液中

10、鉻處理濃度增加到100μM時(shí)，根際pH值明顯高于初始調(diào)節(jié)的pH值(5.10)，說(shuō)明100μM Cr處理嚴(yán)重影響水稻的根系活力以及陰陽(yáng)離子的吸收平衡。隨著鉻脅迫水平的升高，根系分泌的有機(jī)酸含量顯著增加。在測(cè)定的六種有機(jī)酸中，草酸和蘋(píng)果酸含量明顯高于檸檬酸、乙酸、乳酸和琥珀酸，可以認(rèn)為前兩種是鉻脅迫下水稻分泌的主要有機(jī)酸。相關(guān)分析顯示，鉻在水稻體內(nèi)的積累量與根際pH值、草酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸含量呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明根際pH值升高以及草酸、蘋(píng)果酸

11、和檸檬酸分泌量增加導(dǎo)致水稻植株中鉻積累量增多。另外，根際pH值也與草酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸分泌量呈顯著正相關(guān)，表明這三種有機(jī)酸的分泌對(duì)根際pH值的變化可能起有重要作用。
　　 5.水稻鉻吸收的動(dòng)力學(xué)研究
　　 無(wú)論Cr3+還是Cr6+對(duì)各種生物都具有顯著的毒害作用，而且Cr6+的毒性遠(yuǎn)高于Cr3+。植物對(duì)鉻的吸收是鉻植物體內(nèi)積累和對(duì)植物造成毒害的前提，但是，迄今為止，植物對(duì)鉻的吸收動(dòng)態(tài)及模式尚缺乏研究。本試驗(yàn)以水稻為材料，研

12、究了溶液培養(yǎng)條件下水稻根對(duì)Cr3+和Cr6+吸收的動(dòng)力學(xué)特征。結(jié)果顯示，在Cr3+0-250μM和Cr6+0-500μM范圍內(nèi)，水稻根系對(duì)Cr3+和Cr6+的吸收速率均隨著溶液中鉻濃度的提高而增加，并逐漸在高鉻濃度處理下趨于飽和。擬合分析表明，Cr3+和Cr6+的吸收均可用Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)方程描述，Cr3+具有較低的Km值和較高的Vmax值，水稻根系對(duì)Cr3+的親和力和吸收能力均大于Cr6+。在0.5-48 h處理

13、時(shí)間內(nèi)，水稻根系中鉻濃度隨著時(shí)間的推移而增加。但是，Cr3+含量在t=12 h后趨于飽和，而Cr6+含量仍持續(xù)增加。水稻根系對(duì)Cr3+和Cr6+的響應(yīng)速率表現(xiàn)不同，100μM Cr3+處理0.5h后，水稻根中鉻含量可達(dá)400mg g-1 DW，而100μMCr6+處理0.5h后，水稻根中鉻含量不到20 mg g-1 DW，說(shuō)明Cr3+比Cr6+更易被水稻根系吸收，且其達(dá)到吸收飽和較快。另外，Cr吸收的動(dòng)力學(xué)特征顯示兩供試基因型存在著差異

14、，單K5對(duì)Cr3+和Cr6+的Km值和Vmax值都明顯高于秀水113，說(shuō)明單K5對(duì)Cr的親和力雖不如秀水113，但其鉻吸收潛力較大。營(yíng)養(yǎng)液中添加正釩酸鹽和2，4-DNP(代謝抑制劑)，Cr6+的吸收顯著降低，而Cr3+的吸收影響較小，說(shuō)明Cr6+的吸收需要能量參與，而Cr3+的吸收需能較少由此可見(jiàn)Cr6+與Cr3+分別具有不同的吸收途徑或方式。
　　 6.鉻在水稻組織和亞細(xì)胞水平上的分布和化學(xué)形態(tài)特征分析
　　 重金屬在

15、植株體內(nèi)過(guò)量積累是植物受重金屬毒害的重要原因，而植物組織中重金屬的亞細(xì)胞水平分布與重金屬毒害關(guān)系密切。本試驗(yàn)以鉻積累特性不同的水稻品種為材料，采用同步輻射微束X射線(xiàn)熒光光譜分析(μ-SRXRF)、差速離心以及逐步化學(xué)提取法研究了鉻在水稻組織和亞細(xì)胞水平上的分布特點(diǎn)和化合形態(tài)特征，試圖闡明鉻在水稻植株體內(nèi)的吸收、積累的機(jī)理以及水稻的耐性機(jī)制。μ-SRXRF結(jié)果顯示，水稻根系中的Cr絕大部分累積在表皮細(xì)胞中；水稻莖和葉中的鉻則主要分布于表皮

16、和維管束組織，其他組織中的鉻含量非常低，說(shuō)明表皮層細(xì)胞對(duì)鉻的阻隔作用可能是植物體內(nèi)鉻遷移受到限制的重要原因，而水稻根系吸收的Cr則主要通過(guò)木質(zhì)部導(dǎo)管向地上部組織運(yùn)輸。在亞細(xì)胞水平上，不管在何種Cr處理濃度下，水稻根系中的Cr絕大部分都分布在細(xì)胞壁上；而在水稻莖稈和葉片細(xì)胞中，隨著Cr處理水平的升高，Cr在可溶性組分中的分配比例顯著增加。以上結(jié)果表明，細(xì)胞壁和液泡是水稻細(xì)胞內(nèi)Cr的主要分布部位，而細(xì)胞中具有重要代謝功能的細(xì)胞器(如：葉綠體

17、、線(xiàn)粒體等)Cr分布相對(duì)較少。另外，逐步化學(xué)試劑提取法對(duì)水稻植株體內(nèi)鉻的化學(xué)形態(tài)研究表明，低鉻處理下，水稻組織中鉻以乙醇和去離子水提取態(tài)為主，說(shuō)明硝酸鹽、氯化物和氨基酸以及某些水溶性有機(jī)酸對(duì)鉻的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要作用；而高鉻處理下，乙醇和去離子水提取態(tài)比例顯著下降，鹽酸和殘?jiān)崛B(tài)轉(zhuǎn)為鉻的主要存在形態(tài)，表明磷酸鹽、草酸鹽以及難溶性高分子量化合物在阻止鉻在水稻根系中移動(dòng)、緩解鉻毒害上發(fā)揮著一定的作用。
　　 7.水稻葉、根在不同鉻

18、處理下蛋白質(zhì)差異表達(dá)的研究
　　 為了深入闡明植物鉻毒害和耐性的分子機(jī)理，本研究利用雙向電泳和MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)對(duì)Cr積累特性不同的兩個(gè)水稻基因型(秀水113、單K5)葉片和根在0、2、200μM Cr處理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)組表達(dá)的變化進(jìn)行了分析。水稻葉片中鑒定成功41個(gè)蛋白點(diǎn)，其中秀水113有21個(gè)，單K5有20個(gè)，這些蛋白以RuBisco和能量代謝相關(guān)蛋白為主。水稻根系中僅14個(gè)蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定成功，其中秀水113有4個(gè)，單

19、K5有10個(gè)，它們大多數(shù)與環(huán)境脅迫相關(guān)。本研究檢測(cè)到一批對(duì)鉻脅迫有響應(yīng)且表達(dá)上調(diào)的蛋白，如NADP-異檸檬酸脫氫酶、熱激蛋白(Hsp90)、乙二醛酶Ⅰ、蛋白質(zhì)糖基化多肽、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、ATP合成酶以及兩個(gè)信號(hào)分子，G蛋白β亞基和信號(hào)識(shí)別顆粒54蛋白等。這些蛋白質(zhì)中，大部分已被證實(shí)與鹽害、冷害等環(huán)境脅迫的耐性有關(guān)，但在鉻脅迫的耐性研究中涉及非常少，而蛋白質(zhì)糖基化多肽與重金屬等環(huán)境脅迫的關(guān)系為首次報(bào)道。本研究鑒定到

20、的鉻脅迫響應(yīng)蛋白可為深入闡明水稻鉻耐性機(jī)理提供新的契機(jī)。
　　 8.外源還原型谷胱甘肽(GSH)對(duì)水稻鉻毒害的緩解效應(yīng)
　　 本試驗(yàn)通過(guò)分析Cr脅迫下不同濃度GSH處理后水稻植株生長(zhǎng)、葉綠素和可溶性蛋白質(zhì)含量、抗氧化酶活性以及膜脂過(guò)氧化程度的變化，研究了外源GSH處理對(duì)鉻脅迫的緩解效應(yīng)。結(jié)果顯示，100μM Cr處理下，植株生長(zhǎng)、葉綠素和可溶性蛋白含量顯著降低，添加外源GSH后，鉻脅迫造成的抑制效應(yīng)得到明顯緩解，說(shuō)明外源

21、GSH可減輕了Cr脅迫對(duì)水稻幼苗的毒害。100μM Cr處理導(dǎo)致水稻葉片和根系中MDA含量的急劇增加以及某些抗氧化物酶活性的降低，說(shuō)明對(duì)水稻幼苗產(chǎn)生了嚴(yán)重的氧化脅迫，而外源GSH的加入顯著提高葉片和根系的抗氧化物酶活性，降低葉片和根系中的MDA含量，表明GSH可通過(guò)增強(qiáng)水稻的抗氧化能力而減輕鉻的毒害。此外，外源GSH的加入雖然顯著增加根的鉻含量，但顯著降低水稻地上部組織中的鉻含量，即降低了鉻由地下部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，說(shuō)明外源GSH促使更多

22、的鉻滯留在水稻根系，這可能與GSH的還原以及對(duì)金屬離子的螯合區(qū)室化效應(yīng)有關(guān)。
　　 9.硅營(yíng)養(yǎng)對(duì)水稻鉻毒害的緩解效應(yīng)
　　 本試驗(yàn)研究了施硅對(duì)鉻脅迫下水稻植株生長(zhǎng)、可溶性蛋白質(zhì)含量、抗氧化酶活性以及膜脂過(guò)氧化的影響。結(jié)果表明，100μM Cr處理顯著降低水稻株高和干重、可溶性蛋白含量和根系抗氧化酶活性，而明顯增加組織中Cr含量和MDA含量。水培液中添加硅營(yíng)養(yǎng)，鉻脅迫對(duì)水稻植株生長(zhǎng)造成的抑制效應(yīng)得到有效緩解。硅營(yíng)養(yǎng)加入也顯