光敏色素B調(diào)控水稻干旱脅迫耐性的機(jī)理研究.pdf

1、對(duì)高等植物而言，光不僅是光合作用的能量來(lái)源，也是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育最基本的信號(hào)。高等植物利用光敏色素(phytochrome，phy)感受紅光/遠(yuǎn)紅光，參與調(diào)節(jié)植物從種子萌發(fā)到果實(shí)成熟的多個(gè)發(fā)育過(guò)程。水稻光敏色素基因家族包括3個(gè)成員，PHYA、PHYB和PHYC。在對(duì)水稻光敏色素突變體的研究中，我們發(fā)現(xiàn)水稻 phyB缺陷型突變體(phyB)具有較強(qiáng)的干旱脅迫耐性，因此可被用做一種重要的、耐旱新種質(zhì)資源。
　　本研究用phyB突變體和

2、野生型水稻作為研究材料，圍繞根系水分吸收能力和地上部分水分散失兩個(gè)方面，在生理學(xué)和分子生物學(xué)水平上分析了與水稻干旱脅迫耐性相關(guān)的生理變化和相關(guān)基因，旨在揭示水稻 phyB調(diào)控植物干旱脅迫耐性的機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　1.水稻 phyB突變體具有較強(qiáng)的干旱脅迫耐性將在正常條件下生長(zhǎng)的水稻野生型和phyB突變體(六葉期)停止?jié)菜?3天，發(fā)現(xiàn)大部分野生型水稻葉片萎蔫，而 phyB突變體葉片仍保持展開。停止?jié)菜?6天后復(fù)水12天，45.

3、7％的野生型水稻恢復(fù)生長(zhǎng)，而90％的phyB突變體恢復(fù)生長(zhǎng)。這說(shuō)明 phyB突變體具有較強(qiáng)的干旱脅迫耐性。采用15％PEG溶液處理野生型和phyB突變體1～5天，發(fā)現(xiàn) phyB突變體在正常和干旱脅迫條件下的脯氨酸和可溶性糖含量均高于野生型，說(shuō)明 phyB突變體具有較高的滲透調(diào)節(jié)能力。
　　2. phyB突變體與野生型植株的根系沒有明顯差異將水稻野生型和phyB突變體種子根部避光在0.5％的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)至兩葉期。結(jié)果顯示，phy

4、B突變體的主根長(zhǎng)度明顯大于野生型，而根/冠比無(wú)顯著差別。當(dāng)野生型和phyB突變體根部避光在蛭石中培養(yǎng)至六葉期時(shí)，野生型和phyB突變體的根長(zhǎng)也無(wú)顯著差別。利用根系分析儀進(jìn)一步測(cè)定發(fā)現(xiàn)，野生型和phyB突變體的根系長(zhǎng)度、表面積以及直徑也均沒有顯著性差異。這說(shuō)明根系生長(zhǎng)及表面積不是影響 phyB突變體較強(qiáng)干旱脅迫耐性的主要因素。
　　3.phyB突變體表現(xiàn)出較低的失水速率和蒸騰速率比較野生型和3個(gè)不同 phyB等位基因突變體(phyB

5、1，phyB2，phyB5)離體葉片的失水速率。結(jié)果表明，phyB突變體的失水速率明顯小于野生型。進(jìn)一步利用美國(guó)便攜式光合儀(LI-COR LI-6400)在強(qiáng)制光源(1500μmol m-2s-1)下測(cè)定野生型和phyB突變體的光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率，發(fā)現(xiàn) phyB突變體的光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率均低于野生型，而水分利用率在phyB突變體和野生型之間沒有顯著差異。此外我們還發(fā)現(xiàn) phyB突變體植株的總?cè)~面積明顯小于野生型。這

6、些結(jié)果說(shuō)明，在同樣生長(zhǎng)條件下，與野生型相比 phyB突變體就可能具有較低的蒸騰量。這些特征可能是決定 phyB突變體具有較強(qiáng)干旱脅迫耐性的關(guān)鍵因素。
　　4.phyB正調(diào)控氣孔密度通過(guò)印跡法比較了野生型和phyB突變體六葉期發(fā)育完全的第三葉、第四葉和第五葉的氣孔數(shù)目和大小。結(jié)果表明，phyB突變體單位面積上的氣孔數(shù)目和氣孔器長(zhǎng)度均顯著小于野生型。氣孔密度的降低將減少植物與外界環(huán)境之間水分或二氧化碳的交換，導(dǎo)致光合速率和蒸騰速率降低

7、、失水速率降低。
　　5. phyB負(fù)調(diào)控氣孔發(fā)育相關(guān)基因 ERECTA的表達(dá)為了分析 phyB調(diào)控氣孔密度的分子機(jī)制，我們利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析了水稻氣孔發(fā)育相關(guān)基因在野生型和phyB突變體中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，無(wú)論在水稻幼苗時(shí)期的分生組織和葉原基(種子萌發(fā)2天和4天)，還是六葉期植株的成熟葉，ERECTA(ER)家族基因(分別命名為ER、ER1/2和ERL)在phyB突變體中的表達(dá)量均顯著高于野生型。已有報(bào)道表明，ER

8、ECTA基因負(fù)調(diào)控?cái)M南芥氣孔發(fā)育。據(jù)此推測(cè)，phyB可能通過(guò)負(fù)調(diào)控ER基因的表達(dá)而影響水稻葉片氣孔密度。
　　6.ERECTA基因負(fù)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因煙草葉片的水分蒸騰為了進(jìn)一步研究ERECTA基因?qū)λ执x的影響，我們構(gòu)建了植物過(guò)量表達(dá)載體pCAMBIA1390-Ubi-OsERL，轉(zhuǎn)化煙草。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)停止?jié)菜?8天時(shí)，野生型植株的葉片出現(xiàn)萎蔫，顏色較黃，而轉(zhuǎn)基因株系仍可以維持一定膨壓；各轉(zhuǎn)基因株系植株離體葉片的失水速率顯著低于野生型

9、；通過(guò)便攜式光合儀(LI-COR LI-6400)在強(qiáng)制光源(1500μmol m-2s-1)下測(cè)定野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植株的光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率，發(fā)現(xiàn)野生型和轉(zhuǎn)基因株系植株的光合速率沒有顯著差異，而轉(zhuǎn)基因株系植株的蒸騰速率低于野生型，水分利用率高于野生型。以上說(shuō)明，OsERL基因的過(guò)量表達(dá)可能通過(guò)降低植株的失水速率和蒸騰速率來(lái)調(diào)節(jié)植株的耐旱性。觀測(cè)野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植株第六片完全展開葉中段位置上的氣孔分布，結(jié)果表明各轉(zhuǎn)基因株系植

10、株單位面積上的氣孔數(shù)目均少于野生型，表皮細(xì)胞明顯大于野生型，而氣孔發(fā)育形態(tài)沒有明顯差異。這些結(jié)果表明，水稻 ERL基因在煙草中表達(dá)引起表皮細(xì)胞增大，從而導(dǎo)致氣孔密度減小、失水速率和蒸騰速率降低。
　　7.phyB介導(dǎo)的紅光信號(hào)抑制 ERECTA基因的表達(dá)phyB是如何影響 ERECTA基因的表達(dá)呢?利用熒光定量 PCR，我們比較了野生型和phyB突變體在黑暗和紅光條件下的基因表達(dá)水平。結(jié)果表明，在野生型中，ERECTA基因在紅光下

11、的表達(dá)水平低于黑暗條件下的水平，這表明紅光抑制 ERECTA基因的表達(dá)。然而在phyB突變體中，紅光對(duì)ERECTA基因的抑制效果明顯減弱。據(jù)此推測(cè) phyB感受紅光抑制 ERECTA基因的表達(dá)。
　　8。phyB突變體的耐旱性與ABA途徑有關(guān)ABA是一種重要的脅迫激素。為了分析 phyB突變體較強(qiáng)的干旱脅迫耐性是否與 ABA途徑有關(guān)，我們利用種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)比較了野生型和phyB突變體對(duì)外源 ABA的敏感性。結(jié)果表明，phyB突變體對(duì)

12、ABA更為敏感。利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，我們比較了ABA代謝相關(guān)基因在野生型和phyB突變體中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，ABA合成基因在phyB突變體中的表達(dá)水平高于野生型，而降解基因低于野生型。據(jù)此推測(cè)，phyB負(fù)調(diào)控 ABA合成基因的表達(dá)，正調(diào)控 ABA降解基因的表達(dá)。
　　我們比較了野生型和phyB突變體干旱處理不同時(shí)間后的基因表達(dá)圖譜，并通過(guò)半定量 PCR進(jìn)一步驗(yàn)證其中與 ABA途徑相關(guān)基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明，多個(gè) ABA

13、途徑調(diào)控的、與干旱脅迫耐性相關(guān)的基因如脫水素基因、蛋白磷酸酶基因、bZIP基因和脅迫誘導(dǎo)基因等，在phyB突變體中的表達(dá)顯著高于野生型，據(jù)此推測(cè) ABA依賴途徑與 phyB突變體較強(qiáng)的干旱脅迫耐性有關(guān)。
　　總之，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究正常和干旱脅迫條件下，水稻 phyB突變體與野生型的相關(guān)生理指標(biāo)、氣孔發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)及功能、以及ABA途徑相關(guān)基因的表達(dá)模式探討光敏色素參與耐旱的機(jī)理。我們初步認(rèn)為，一方面，phyB負(fù)調(diào)控 ERECTA基