適度干旱脅迫調(diào)控甘草次級(jí)代謝分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）為豆科多年生草本植物，其根和根莖入藥，具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥之功效，在日用化學(xué)品、食品中廣泛用作甜味劑。隨著人類對(duì)甘草需求的日益增長(zhǎng)，甘草資源被過(guò)度開發(fā)。保護(hù)野生甘草資源和提高人工栽培甘草的質(zhì)量是解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵因素。
　　甘草在我國(guó)產(chǎn)于西北、華北和東北等地，適于生長(zhǎng)在干旱半干旱的環(huán)境中。土壤水分條件可以直接影響甘草的產(chǎn)量和品質(zhì)。研究表

2、明：適度的干旱脅迫（土壤相對(duì)含水量40％~45%）可以促進(jìn)甘草中甘草苷、甘草酸等有效成分的積累，提高藥材品質(zhì)。本論文在此基礎(chǔ)上建立6月齡甘草適度干旱脅迫實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究適度干旱脅迫調(diào)控甘草次級(jí)代謝的分子機(jī)制，為提高栽培甘草的有效成分含量，實(shí)施甘草資源的可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。
　　本論文采用稱重補(bǔ)水法控制土壤干旱脅迫程度；高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定兩組甘草中甘草苷和甘草酸的含量；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)得到響應(yīng)干旱脅迫的基因

3、信息，通過(guò)功能注釋和分類，篩選出調(diào)控適度干旱脅迫下甘草有效成分生物合成的關(guān)鍵基因；以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的相關(guān)序列為基礎(chǔ)，挑選紫杉烯5-α羥化酶和鯊烯合酶為研究對(duì)象，半定量RT-PCR技術(shù)分析干旱脅迫對(duì)其基因表達(dá)的調(diào)控；利用生物信息學(xué)方法對(duì)甘草中紫杉烯5-α羥化酶cDNA序列（GuT5H）及其編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，為深入研究該基因功能和解析適度干旱脅迫促進(jìn)甘草有效成分積累的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　研究結(jié)果如下：

4、>　　1.HPLC法測(cè)定適度干旱脅迫組與對(duì)照組甘草中甘草苷和甘草酸含量，結(jié)果表明適度干旱脅迫處理能夠促進(jìn)6月齡甘草根中甘草苷、甘草酸的積累。
　　2.對(duì)兩組甘草進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，經(jīng)拼接得到得到的Unigene和all-unigene的序列長(zhǎng)度集中在300~3000 nt，平均為1400 nt。使用RPKM法篩選兩樣本間的差異表達(dá)基因，適度干旱脅迫對(duì)甘草根次級(jí)代謝、脅迫響應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑的功能基因均有顯著的調(diào)控作用，表明干旱脅迫對(duì)甘

5、草的生長(zhǎng)發(fā)育和有效成分積累的調(diào)控是多途徑的，涉及脅迫信號(hào)與植物激素等調(diào)節(jié)因子在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的相互作用。
　　3.半定量RT-PCR法分析紫杉烯5-α羥化酶基因（GuT5H)、鯊烯合酶(GuSQS)的表達(dá)模式，在適度干旱脅迫過(guò)程中兩者均發(fā)生上調(diào)表達(dá)，該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果一致。
　　4.生物信息學(xué)結(jié)果表明甘草GuT5H的cDNA全長(zhǎng)1602 bp，開放讀碼框?yàn)?428 bp，編碼475個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。GuT5H與大