Perilipin 5調(diào)控肝臟脂滴代謝的分子機(jī)制研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）等疾病在肝臟的重要表現(xiàn)形式，其主要病理特征是彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性。目前研究認(rèn)為，盡管脂質(zhì)過(guò)度沉積與NAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但肝細(xì)胞內(nèi)的中性脂質(zhì)并不是誘發(fā)非酒精性脂肪性肝炎（ non-alcoholic steatohepatitis，NASH）的直接原因，NASH發(fā)生的核心是

2、肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）代謝所導(dǎo)致的脂毒性。過(guò)量的FFA在肝細(xì)胞中主要以甘油三酯（triglyceride，TG）的形式儲(chǔ)存在脂滴（lipid droplets，LDs）中。因此，脂滴代謝異常與肝臟脂毒性損傷密切相關(guān)。脂滴以前被認(rèn)為僅僅是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存中性脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但目前大量研究認(rèn)為，脂滴也是一個(gè)代謝活躍的多功能細(xì)胞器，在細(xì)胞的脂質(zhì)儲(chǔ)積、能量供應(yīng)、膜結(jié)構(gòu)形成、病毒復(fù)制和蛋白降解等過(guò)程中發(fā)揮著重

3、要作用。脂滴主要由三部分組成，包括中性脂質(zhì)的核心，覆蓋于其表面的單層磷脂以及鑲嵌在磷脂層上的脂滴蛋白（lipid droplet-associated proteins，LDPs）。其中，Perilipin家族是一組重要的脂滴蛋白，在調(diào)控脂滴代謝和維持細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)平衡中發(fā)揮著重要的作用。
　　作為Perilipin家族的最新成員，Perilipin5（Plin5）主要表達(dá)于高氧化代謝的組織中，如肝臟、心臟、骨骼肌和褐色脂肪組織（br

4、own adipose tissue，BAT）等。目前已有多項(xiàng)研究對(duì)Plin5在心臟和骨骼肌中的作用進(jìn)行了深入研究，我們也利用基因敲除小鼠，初步研究了Plin5在肝臟中的作用，發(fā)現(xiàn)Plin5敲除小鼠繁殖能力正常，體重、血糖、血脂、胰島素敏感性等均未見(jiàn)明顯異常，但肝臟中脂肪含量降低，并出現(xiàn)肝臟損傷的表現(xiàn)。然而，Plin5缺失對(duì)小鼠肝臟脂肪代謝的具體影響和作用機(jī)制仍有待深入研究。
　　本研究首先利用人肝臟石蠟標(biāo)本和脂肪肝模型小鼠，確定

5、了Plin5表達(dá)水平與脂肪肝之間的關(guān)系；利用Plin5敲除小鼠模型及體外過(guò)表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)一步確定了Plin5缺失對(duì)肝臟形態(tài)和脂肪代謝的影響，并闡明了Plin5調(diào)控肝臟脂滴脂解的分子機(jī)制；最后，我們研究了Plin5和Cideb的相互作用以及二者對(duì)肝臟脂滴形態(tài)的影響。
　　1）Plin5在脂肪肝中表達(dá)水平升高
　　Plin5主要分布在肝小葉中央靜脈周?chē)?，此部位是代謝相關(guān)肝臟脂肪變的常見(jiàn)區(qū)域。利用免疫組化，我們發(fā)現(xiàn)Plin5在單純性

6、脂肪肝和NASH患者肝臟中表達(dá)水平升高，其表達(dá)水平與NAFLD的發(fā)展密切相關(guān)。在ob/ob肥胖小鼠、高脂飲食（high-fat diet，HFD）或饑餓誘導(dǎo)小鼠的脂肪肝組織中，Plin5的表達(dá)水平均明顯升高，進(jìn)一步說(shuō)明Plin5表達(dá)水平與脂肪肝發(fā)生密切相關(guān)。盡管在脂肪肝中Plin2的表達(dá)水平也明顯升高，但我們發(fā)現(xiàn)，在饑餓誘導(dǎo)的小鼠脂肪肝的脂滴中，Plin5的升高水平明顯高于Plin2，提示Plin5在肝臟脂滴累積過(guò)程中扮演十分重要的角色

7、。
　　2）Plin5缺失導(dǎo)致小鼠肝臟脂毒性損傷
　　為了明確Plin5在肝臟脂肪代謝中的具體作用，我們利用Plin5敲除小鼠和原代肝細(xì)胞，分析了Plin5缺失后小鼠肝臟氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、纖維化以及線粒體功能等的變化情況。結(jié)果顯示，Plin5缺失導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞的脂解速率明顯加快，細(xì)胞內(nèi)FFA水平明顯升高，血清中酮體含量也明顯升高。同時(shí)，Plin5缺失導(dǎo)致小鼠肝臟中活性氧（reactive oxygen spec

8、ies，ROS）水平升高，肝臟出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和明顯的炎癥反應(yīng)，表明Plin5缺失能夠誘發(fā)肝臟脂毒性損傷。此外，Plin5敲除小鼠肝臟中PPARα被激活，線粒體呼吸鏈復(fù)合體關(guān)鍵分子的表達(dá)水平升高，表明Plin5缺失增強(qiáng)了線粒體的氧化磷酸化能力。這些結(jié)果表明，Plin5缺失導(dǎo)致的肝細(xì)胞內(nèi)FFA水平升高，激活了PPARα，并加速肝細(xì)胞中FFA的氧化分解，以減輕肝細(xì)胞內(nèi)FFA過(guò)多導(dǎo)致的肝臟脂毒性損傷。
　　3）Pli

9、n5通過(guò)與CGI-58相互作用，抑制ATGL的脂解活性
　　為了確定Plin5調(diào)控肝細(xì)胞脂滴脂解的分子機(jī)制，我們首先檢測(cè)了Plin5敲除小鼠肝臟中Perilipin家族蛋白以及脂質(zhì)合成和分解關(guān)鍵分子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Plin5缺失能夠降低肝臟中Plin2的表達(dá)水平，但未影響Plin3的表達(dá)。同時(shí)，Plin5敲除小鼠肝臟中調(diào)控FFA合成的關(guān)鍵酶FAS和ACC的表達(dá)降低，但調(diào)控TG合成的關(guān)鍵酶DGAT2、脂解酶ATGL及其共激活因

10、子CGI-58的表達(dá)水平均未見(jiàn)明顯變化。進(jìn)一步研究我們發(fā)現(xiàn)，Plin5能夠與CGI-58相互作用，且Plin5的212-382aa是與CGI-58相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。我們還發(fā)現(xiàn)，Plin5與CGI-58的相互作用能夠阻止后者與ATGL的結(jié)合，而Plin5缺失肝細(xì)胞的脂解速率加快，且在過(guò)表達(dá)ATGL和CGI-58時(shí)加快更為顯著。這些結(jié)果表明，在肝細(xì)胞中，Plin5通過(guò)與CGI-58相互作用，阻斷CGI-58與ATGL的結(jié)合，從而抑制AT

11、GL的脂解活性。
　　4）Plin5能夠與Cideb相互作用，二者在脂滴形成過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用
　　除了脂解，脂滴的形成和轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程在細(xì)胞脂肪代謝中也具有重要作用。我們?cè)缙诘难芯匡@示，Plin5與Cideb之間可能存在相互作用，而Cideb是肝臟中表達(dá)水平最高的CIDE家族成員，其在肝細(xì)胞脂滴形成過(guò)程中具有重要的作用。為了深入研究Plin5和Cideb在肝臟脂滴形成過(guò)程中的作用，我們首先利用基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，Cideb敲

12、除小鼠肝臟中Plin5的表達(dá)水平明顯升高，在Plin5敲除小鼠肝臟中Cideb的表達(dá)水平也略有升高。Plin2在Plin5敲除小鼠肝臟中表達(dá)降低，而在Cideb敲除小鼠肝臟中表達(dá)升高，這與敲除小鼠肝臟的脂肪含量正相關(guān)。Plin5缺失導(dǎo)致肝細(xì)胞中脂肪含量降低，主要表現(xiàn)為脂滴數(shù)量明顯減少，但過(guò)表達(dá)Cideb并不能夠增加Plin5缺失肝細(xì)胞中的脂肪含量。然而，在Cideb缺失肝細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Plin5能夠明顯增加脂滴的數(shù)量，但對(duì)脂滴大小沒(méi)有明顯

13、影響，表現(xiàn)為更多小脂滴的儲(chǔ)積。利用免疫熒光技術(shù)，我們確定了Plin5和Cideb在細(xì)胞中有共定位，且Plin5和Cideb能夠相互作用，Cideb的C端（118-219aa）是其與Plin5相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。因此我們認(rèn)為，不同于Cideb的促脂滴融合作用，Plin5能夠增加肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量，表明Plin5也參與了脂滴的形成過(guò)程，但是Plin5與Cideb的相互作用在肝臟脂滴形成過(guò)程中的具體作用仍有待深入研究。
　　綜上所述，

14、Plin5的表達(dá)水平與NAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Plin5能夠與ATGL的共激活因子CGI-58相互作用，抑制ATGL的活性，減少肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的脂解。Plin5缺失的肝細(xì)胞中，脂滴表面CGI-58與ATGL結(jié)合增加，ATGL脂解活性被激活，導(dǎo)致肝細(xì)胞中脂滴含量減少，F(xiàn)FA含量增加。肝細(xì)胞中升高的FFA激活PPARα，導(dǎo)致其下游一系列與脂肪代謝密切相關(guān)的分子的表達(dá)。同時(shí)線粒體增殖，氧化磷酸化能力增強(qiáng)，增加β氧化以清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的FFA